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明胶酶谱法操作实验（实验简介,实验步骤,所需试剂）
Release Time：2020-08-05一、明胶酶谱法操作实验简介：
明胶酶谱法操作实验中酶谱学的基本过程是先进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离样品，然后在二价缓冲液中制备样品中的MMP-2和MMP-2金属离子恢复MMP-9的活性，凝胶中的明胶在相应的迁移位置处水解，最后凝胶用考马斯亮蓝染色，然后脱色。白色带可能出现在蓝色背景上。条带的强度类似于MMP-2，与MMP-9活性成正比。
重折叠原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMP结合（当然是可逆结合），破坏了氢键和疏水键，因此MMP不能发挥其分解明胶的作用，只有将凝胶放入Trition洗脱（最好在摇床上摇动30分钟/次，进行2或15min /次，摇动4次。不宜在Trition中静置。），因为SDS受Trition束缚并被除去，因此MMP恢复了活动。
二、明胶酶谱法操作实验步骤
1.取对数期癌细胞，并在无血清培养基DMEM中培养24小时。
2.第二天收集上清液，将上清液转移到离心管中，以2000 rpm的速度离心10分钟，并保存在-70°C下以备后用。
3.根据细胞数调整每组细胞培养上清液中的蛋白质浓度（或测量蛋白质浓度并调整蛋白质总量使其一致）。与5x上样缓冲液，13ul样品+ 4ul上样缓冲液混合。（请勿用枪猛吹，以免产生过多气泡）
4.准备分离凝胶和浓缩凝胶，加样量为16ul /孔（根据表达强度和蛋白质浓度确定样品量），在4℃下进行SDS-PAGE电泳100v约1.5小时（电泳过程中加冰，有利于带钢直行）。
5.电泳结束后，将凝胶放入洗脱液（2.5％Triton X-100、50mmol / L Tris-HCl，5mmol / L CaCl2，pH 7.6）中，摇动并洗脱两次，每次40分钟，然后使用漂洗溶液（Triton X-100除外，其余与洗脱液相同）漂洗两次，每次20分钟，然后将凝胶放入温育溶液中（50mmol / L Tris-HCl，5mmol / CaCl2、0将0.02％的Brij-35，pH7.6）在37℃孵育42小时。
6.孵育后，用染色溶液（0.05％考马斯亮蓝，30％甲醇，10％乙酸）染色3h，并对溶液A，B，C进行脱色（甲醇浓度分别为30％，20％，10％） ，醋酸浓度（分别为10％，10％，5％）脱色0.5、1、2h后，表明MMP-2（72KD）和MMP-9（92KD）在蓝色背景上是亮带。凝胶图像分析系统分析并读取谱带面积，宽度和灰度值，并进行统计分析。
三、明胶酶谱法操作实验注意事项：
1.制备聚丙烯酰胺时应注意避免气泡。
2.明胶酶谱图的活性受钙离子，锌离子和pH值等因素影响。因此，缓冲液的制备应严格而准确，应尝试使用超纯水，并且应控制孵育温度。
3.用大梳子
4.孵育溶液的pH值应在7.5至7.6之间。如果复性的TRITON时间长，则会有絮状物，因此在实验过程中尝试使用新的配置。
5.请勿在二氧化碳培养箱中以37度进行培养，因为这会改变培养液的pH值，就像在普通培养箱中一样。
6.明胶应储存在4°C下，制备后1周内使用。
7.凝胶准备：
①将玻璃板对齐后，将其放入夹具中，垂直夹紧，并装满水以进行泄漏检测。
②使用10％的分离胶，使用APS和TEMED促进凝结，并在填充前添加。如果板没有泄漏，请倒水，用吸水纸清洗，然后倒胶，将其倒至大约3/4点，加水并弄平。
③用浓缩胶水类似地，最后添加APS和TEMED。倒入分离胶约30分钟，观察小烧杯中剩余的分离胶是否凝结。同时，仔细观察玻璃板上的水和胶之间有一条折线，表明胶已固化。
④倒出上面的水，用吸水纸洗净，倒入浓缩胶，填满，注意不要有气泡，然后插入梳子，注意保持水平，约30分钟后即可使用。
⑤将梳子拉入电泳缓冲液，用小注射器冲洗样品孔并上样。装入样品时，请勿使样品逃逸到相邻的孔中。样品应轻度混合，不要产生气泡，否则将添加样品。容易导致逃逸并导致结果不准确。
四、明胶酶谱法操作实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 丙烯酰胺 | LSH54449 | 79-06-1 | |
| 2 | N-N’-亚甲双丙烯酰胺 | SF0004 | 110-26-9 | |
| 3 | 乙醇 | CCF12679 | 127852-29-3 | |
| 4 | BIS | HXH501723 | 92995-45-4 | |
| 5 | Tris | SS1426 | 77-86-1 | |
| 6 | SDS | SS0013 | 151-21-3 | |
| 7 | 过硫酸铵（APS） | JT10928 | 7727-54-0 | |
| 8 | TEMED | HC1303 | ||
| 9 | 明胶 | SW0002 | 9000-70-8 | |
| 10 | Tris-HCl | HC2055 | ||
| 11 | 甘氨酸 | SS3763 | 56-40-6 | |
| 12 | 甘油 | JT26018 | 56-81-5 | |
| 13 | 溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 14 | Triton X-100（曲拉通X-100） | SS0049 | 9002-93-1 | |
| 15 | CaCl2 | JT0418 | 10043-52-4 | |
| 16 | NaCl | JT0001 | 7647-14-5 | |
| 17 | 甲醇 | JT25999 | 67-56-1 | |
| 19 | 36%乙酸 | JT11990 | 64-19-7 | |
| 20 | 常规考马斯亮蓝染色液 | HC1247 |
