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荧光素FITC标记抗体的实验（实验方法,实验介绍,实验步骤,实验所需试剂）
Release Time：2020-07-23一，荧光素FITC标记抗体实验介绍
荧光素FITC标记抗体实验中当FITC与抗体蛋白在碱性溶液中进行反应时，抗体蛋白上的赖氨酸r-氨基可以与荧光素中的硫碳键进行结合形成FITC蛋白结合物，即是荧光抗体或者荧光结合物。IgG分子一般会有86个赖氨酸的残基，通常情况下最多可以结合约为15至20个。 IgG分子可以结合2-8个FITC分子，反应公式如下：FITC-N = C = S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质Marsshall（于1958）方法通常用于标记荧光抗体，Chadwick等人的标记方法通常用于标记荧光抗体或Clark等人的透析标记方法，也可以根据条件使用。
二，荧光素FITC标记抗体的实验步骤
1.马歇尔实验法
（1）抗体球蛋白溶液，0.5 mol / L（pH 9.0）碳酸盐缓冲液，异硫氰酸荧光素，1％硫柳汞水溶液，无菌盐水，50ml小烧杯，4℃冰箱，透析袋，玻璃棒，电磁搅拌器，0.01mol/L PBS pH 7.2或3.0，等等。
（2）实验方法与步骤
①抗体的制备在烧杯中取适量的已知浓度的球蛋白溶液，加入人盐和碳酸盐缓冲液，使最终的免疫球蛋白浓度为20mg / ml，碳酸盐缓冲液的总量为总量的1/10，混合均匀，将燃烧的球放在电磁搅拌器上（速度应适当避免起泡）5-10分钟。
②荧光素的制备根据要标记的蛋白质总量，每mg免疫球蛋白可添加0.01 mg荧光色素，并用分析天平准确称量所需的异硫氰酸荧光素粉末。下式还可以用于计算免疫球蛋白和荧光素的量，还可以计算要添加的缓冲液的量。
蛋白质溶液：含量Amg/m1；体积Bml。
B.总蛋白质量（AXB）=碎片。
C. C / 20?C / 10 = Dmg（如果蛋白质含量低于20mg / ml，则使用C / 10；如果蛋白质含量高于20mg / ml，则使用C / 20）。
D.荧光素FITC的量：（1/50?2/100）XC = Emg。
E.0.5 mol / L（pH 9.5）的碳酸盐缓冲溶液D / 10 = Fml。
F.PBS D-（B + F）= Gml的量。
注意：A是蛋白质含量，mg / ml； B是蛋白质溶液的体积； C是总蛋白质，mg； D是常数mg；阳性是荧光素的量，mg； F是碳酸盐缓冲液的体积，Ml； G是PBS的体积，ml。
③组合（或标签）搅拌下逐渐将称量的荧光颜料添加到球蛋白溶液中，避免荧光素粘在烧瓶壁上（约5-10分钟内），添加后继续避光并搅拌约12h 。在结合期间，蛋白质溶液应保持在约4°C，因此将烧杯和搅拌器移至4°C冰箱中。
④透析，结合后，将标记的球蛋白溶液（2500r / min）离心20rains，除去少量沉淀物，放入透析袋中，然后放入烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0? 4?C）隔夜。
⑤跨柱隔夜透析标记，使其通过Sephadex G-50或G-25柱分离游离的荧光素，并收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）;过滤体积：12ml标记的全局蛋白溶液（在过滤前不透析）；收集量：20ml（稀释约1.7倍）。
2. Chadwick方法
（1）试剂和材料抗体球蛋白溶液，异硫氰酸荧光素，0.01mol / L pH8.0PBS，1％硫柳汞，3％碳酸钠水溶液，离心和离心管，烧杯（25ml）搅拌器，无菌移液管，无菌移液管和毛细管滴管，烧杯（500ml）透析袋等
（2）方法与步骤
①抗体制备将球蛋白溶液在0?4°C下用pH 8.0磷酸盐缓冲液稀释至30-40 mg / ml的浓度，将其放入25ml的烧杯中，然后放入冰罐中。
②制备荧光颜料的方法是，每毫克免疫球蛋白加入0.01荧光素荧光素，称量所需的荧光素并将其溶于3％的碳酸钠水溶液中。
③将制备好的抗体和荧光色素溶液等量混合，充分搅拌，然后在0?4°C的冰箱中混合（最好在磁力搅拌器上搅拌）18?24h。
④透析和柱色谱法与马歇尔法相同。
三，荧光素FITC标记抗体的实验所需试剂清单：
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1. | 6-硝基-二乙酸荧光素 | JSH67195 | 53299-21-1 | |
| 2. | 赖氨酸 | SS3405 | 56-87-1 | |
| 3. | IgG | |||
| 4. | 肌球蛋白 | SS2170 | 100684-32-0 | |
| 5. | 碳酸盐缓冲液 | HC0811 | ||
| 6. | 异硫氰酸 | SS4104 | 593-84-0 | |
| 7. | 硫柳汞 | DBK500590 | 54-64-8 | |
| 8. | DTT-PB溶液 | HC1364 | ||
| 9. | 磷酸盐缓冲液 | HC1488 | ||
| 10. | 碳酸钠 | JT0602 | 497-19-8 |
