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重组克隆筛选实验（实验介绍,实验步骤,实验注意事项,实验所需的试剂）
Release Time：2020-07-23一、重组克隆筛选实验基本介绍：
二、重组克隆筛选实验所需材料及试剂：
2.扩增核酸内切酶Kpn I和10x消化缓冲液。
3.扩增核酸内切酶Xbal I和10x消化缓冲液。
4. TAE运行缓冲区或TBE运行缓冲区
5.琼脂糖
6.6x loading：0.25％溴粉蓝，40％（w / v）蔗糖水溶液，储存在4°C下。
三、重组克隆筛选实验的步骤：
1）将1微克重组质粒DNA和2微升相应的10×M缓冲溶液，添加到灭菌的0.5mL EP管中，然后将无菌的再蒸馏水添加至消化的总体积20微升中，并混合溶液在管中。然后加入1微升KpnI和Xbal I酶溶液进行双重消化，用手指轻拂试管壁以混合溶液，或用微量离心机摇动以将溶液浓缩在试管底部。如果同时进行多个酶消化反应，建议均匀添加相同的成分，混合并分装，最后添加DNA样品。
酶消化反应样品表：
2）混合反应系统后，将EP管放在合适的支架上（例如插入泡沫板上），并将其在37°C水浴中放置2h-3h，以完成消化反应。
3）在每个试管中加入2微升的0.1mol / L EDTA（pH8.0），充分混合以终止反应，或将其置于65℃的水浴中10min以使延伸的核酸内切酶失活。不同的酶灭活条件可能不同。灭活的酶消化液储存在冰箱中以备后用。
4）琼脂糖凝胶电泳检测限制性反应的结果。
四、重组克隆筛选实验需要注意事项：
1.影响体内核酸内切酶活性的因素包括：
a）酶切位点周围的双链核苷酸碱基的性质；
b）识别序列在DNA中的分布频率；
c）与DNA的构象有关（SC，L，OC）；
d）DNA纯度
因此，应注意尽量减少影响消化的因素。
2.市售酶的总浓度非常大。
3.由于EDTA的存在会抑制连接酶的活性，因此通常通过加热终止消化反应。4.在酶消化反应的整个过程中，应注意移液器吸头的清洁度，以免污染酶。为防止酶活性降低，应在冰上操作该酶，且作用应迅速。
五、重组克隆筛选实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 10ul白吸头(灭菌) | FT-10-H | ||
| 2 | 0.5ml尖底连盖离心管 | F-EP005 | ||
| 3 | Tris-Hcl | HC2055 | ||
| 4 | EDTA | WSH44880 | 65501-24-8 | |
| 5 | 溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 6 | 溴化乙锭 | SS1957 | 1239-45-8 | |
| 7 | 蔗糖 | SS1498 | 57-50-1 |
