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学习Ficoll密度梯度离心法技能
Release Time：2020-07-21一、Ficoll密度梯度离心实验原理
Ficoll密度梯度离心实验中，常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，W水性高，平均分子量约为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重相对小于或者等于分层液的比重，离心后漂浮在分层液的液面以上，也会有少量的细胞悬浮于分层液中。吸取分层液液面以上部分的细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞。
二、Ficoll密度梯度离心实验所需材料
比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。0.2％台酚兰染色液，Hank's液(无钙镁)、10％小牛血清RPMI1640、用生理盐水或等渗的PBS进行配制、短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。无菌干燥注射器针头。碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。血球计数板、显微镜、水平式离心机。
三、Ficoll密度梯度离心实验的步骤
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处，有以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，该单个核细胞包括有：淋巴细胞和单核细胞。除此之外，还含有血小板。
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×10４×2(稀释倍数)
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
※ 活细胞百分率=活细胞数/总细胞数×100％;用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
四、Ficoll密度梯度离心实验注意事项
1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人的淋巴细胞不同，配制相应密度的Percoll或采用不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
五、Ficoll密度梯度离心实验所需试剂清单
| 序号 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | Hanks平衡盐溶液 | HC1153 | ||
| 2 | PBS缓冲液 | HC2031 | ||
| 3 | 0.4%台盼蓝染液 | SX0153 | 72-57-1 | |
| 4 | 乙醇 | JT26000 | 64-17-5 | |
| 5 | 聚蔗糖 | SS1902 | 26873-85-8 | |
| 6 | 泛影葡胺 | SS0620 | 131-49-7 |
