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聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶电泳)电泳与银染方法
Release Time：2020-07-08一、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶电泳)电泳与银染实验简介：
PAGE凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）主要使用PAGE作为介质根据大小和电荷分离DNA分子。 PAGE凝胶电泳采用银染法进行显色。银染的原理：首先，银离子（通常为AgNO3）和DNA的结合；其次，还原剂甲醛将Ag +还原为银颗粒，最终DNA呈黑褐色。
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体组成，在催化剂TEMED（N，N，N，N'-四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链聚丙烯酰胺，在交联剂N的参与下， N'-亚甲基双丙烯酰胺（交联剂），聚丙烯胺链交联形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的孔径取决于丙烯酰胺和交联剂的浓度和比例。下表显示了不同浓度下丙烯酰胺和DNA的有效分离范围。
丙烯酰胺（％）有效分离范围（bp）溴酚蓝*二甲苯绿*
3.5 100～2000 100 460
5.0 80～500 65 260
8.0 60～400 45 160
12.0 40～200 30 70
15.0 25～150 15 60
20.0 10～100 12 45
*表中给出的数字是双链DNA分子中包含的碱基对（bp）的数目，其等于指示剂的迁移率。
二、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶电泳)电泳与银染实验所需试剂
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 聚丙烯酰胺 | HCC340648 | 9003-05-8 | |
| 2 | 丙烯酰胺 | LSH54449 | 79-06-1 | |
| 3 | 甲醇 | JT25999 | 67-56-1 | |
| 4 | 乙醇 | JT26000 | 64-17-5 | |
| 5 | 过硫酸铵 | JT10928 | 7727-54-0 | |
| 6 | 硼酸 | JT0008 | 10043-35-3 |
2.玻璃板加工试剂：
（1）KOH /甲醇溶液：将5g KOH溶于100ml甲醇中，然后用于清洁玻璃板。
（2）95％乙醇
（3）亲和硅烷溶液：95％乙醇4ml
冰醋酸20ul
亲和硅烷20ul
（4）玻璃硅烷：使用移液管在短板上取适量，并用无尘擦拭纸均匀涂抹。
2.丙烯酰胺溶液45％
丙烯酰胺：43.4克
N，N'-亚甲基双丙烯酰胺：1.6克
H2O，加至100ml
装在棕色瓶中，可以在4℃下保存两个月。
3.变性尿素0.7g / ml：称重175g，将其溶于125ml水中，使体积达到250ml。
4.过硫酸铵0.1g / ml：称取1g过硫酸铵，加水至10ml。可以在4℃下保存1周，在-20℃下保存1个月。
5. TEMED（四甲基乙烯基二胺）：用作与过硫酸铵交联反应的催化剂。容易吸收水分并保持在4℃。
6.1XTBE电泳缓冲液
TBE电泳母液的制备（5×）
1）称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20毫升0.5mol / EDTA（PH = 8.0）
2）将每个组添加到1升烧杯中，并用ddH2O补足1升。
3）电泳时使用1次工作溶液，并按1：4的比例与水混合。
4）单一解决方案是增加电泳工作溶液的当前用量。
5）存放在玻璃瓶中，并在室温下存放。
使用相同的TBE制备凝胶和电泳溶液，因为两者之间的微小差异会导致DNA变形。
7.加载缓冲液：包含变性剂
8.超纯水和灭菌超纯水
三.聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶电泳)电泳与银染方法中聚丙烯酰胺凝胶的制备
根据分离的DNA片段的大小和凝胶的体积，制备聚丙烯酰胺凝胶。
1.玻璃板处理：将KOH /甲醇溶液或KOH溶液浸入玻璃板中一定时间，用洗涤剂和水洗涤，最后用两次蒸馏水冲洗两次。让其自然干燥。用95％乙醇擦拭长板和短板。用亲和硅烷和玻璃硅烷均匀擦拭长板和短板。 5-10分钟后，用95％乙醇擦拭长短板。
2.固定玻璃板：将表面朝上，将两个密封垫放在两侧，然后将梳子放在长板一端的两个密封垫之间。短板将向下的盖板装到长板上，用夹子将其固定，然后用梳子密封接缝的其他三个侧面（末端除外），以防止胶水泄漏。在长边方向（300）和短边方向（200-300）上将固定的玻璃板倾斜到合适的角度
3.制备的胶溶液（5％）：原胶：8.34ml
尿素：45毫升
5xTBE：15ml
双蒸馏水：6.66ml
TEMED: 30-36ul
均价：240ul
注意：由于尿素很难在室温下溶解，因此在制备胶之前，应将尿素溶液放入55°C水浴中进行预热，因为尿素已完全溶解。
4.灌胶：取下梳子，用注射器吸取约50ml的胶液，然后在两板之间慢慢注入胶液。当胶水即将溢出时，将玻璃板放平，倒置梳子，然后用夹子将其夹紧。梳子和玻璃之间没有间隙，以防止斑点时划伤。在整个过程中不要产生气泡。
5.固化：填充胶水后，将其设置在室温下使其自然固化。观察胶水边缘的折射线表明胶水已固化。该凝胶可立即使用，或在室温下保存24小时，在4°C下保存48小时。
四．聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.将玻璃板固定到电泳仪上：取下玻璃板上的夹子，撕下胶带，用水冲洗玻璃板，然后将短板向内固定在电泳仪固定器上，即凹口板朝向电泳仪支架。电泳溶液。
2.电泳前：将200ml 5xTBE稀释至1000ml，制成1xTBE。将大约500毫升的1xTBE倒入电泳仪的下部槽中，并将1xTBE倒入上部槽中，以使液位高于短板的上边缘。拔出梳子，并用注射器吸收适量的电泳液清洁斑点（因为除去梳子后，吸附在梳子上的丙烯酰胺和凝胶顶部的未聚合丙烯酸将流入样品孔并聚合，导致表面不规则，这将导致DNA电泳条带图案不规则。
开启变压器，将电压调节至80W，预电泳30min。
3.电泳：
1）样品加载：插入一把梳子，在预电泳过程中将选择性扩增产物在94°C变性10分钟，然后迅速将其放在冰上冷却。将样品缓冲液以2：1的比例添加到选择性扩增产物中，并充分混合。取5-6ul上样。
2）将电压调节至60W，并进行电泳约2小时。根据指示剂迁移位置确定是否终止电泳。电泳完成后，关闭电泳仪。取下玻璃板，用冰袋冷却，然后准备显色。
聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检测> 10ng或更大的DNA条带。它要求更高的灵敏度，并且可以被银染。
五.聚丙烯酰胺凝胶电泳显色----银染
银染的原理：银离子和DNA的结合，还原剂甲醛将银离子还原成银颗粒，使DNA条带呈现深褐色。它的灵敏度是EB的200倍，但是经过银染后，DNA不能回收。
1.固色：固色液冰醋酸：150ml（10％）
双蒸馏水：1350ml
将冷却的橡胶板放入装有1.5L的塑料托盘中，并摇动约30分钟。
2.清洗胶水：将固定的橡胶板放入盛有1.5升双蒸馏水的塑料皿中，每次清洗两次，每次2-4分钟。
3.染色：染色溶液硝酸银：1.5g（0.1％）
37％甲醇：2.25毫升
加双蒸馏水至1.5L
将清洁的橡胶板放入装有染色液的塑料托盘中，并在振荡器上摇动约30分钟。
4.清洗胶水：将固定的橡胶板放入盛有1.5升双蒸馏水的塑料皿中，并清洗一次。此步骤应该很快，大约3秒钟。
5.显色性：碳酸钠显色性溶液：45g（0.03g / ml）
37％甲醛：2.25毫升（0.15％）
硫代硫酸钠：300ul（10mg / ml）
加双蒸馏水至1.5L
将清洁过的橡胶板放入装有彩色显影液的塑料皿中以显色。根据条带和背景的色深调整显色时间，以达到清晰的DNA条带的目的。彩色显影液必须预冷至4-10，否则背景会加深。
6.终止显色：将染过的橡胶板放回装有固定剂的塑料托盘中，反应3分钟。用双蒸馏水洗涤两次（每次2分钟）。
7.干胶：橡胶板在室温下自然干燥。
8.剥离统计信息。
实验注意事项：
1.只要指示灯颜色消失，固定时间就可以减少
2.增加硝酸银（0.2％）的浓度可以减少染色时间。
注意：PAGE凝胶电泳后，使用银染方法显色。尽管它的敏感性比EB的敏感性高得多，但是这种方法不利于DNA的回收。
