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石蜡切片的骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色法(采用石蜡切片)
Release Time：2020-07-08一．骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色实验简单介绍
了解活骨代谢的状态是研究相关细胞生理活性的有效方法。可以用碱性磷酸酶（ALP）对骨组织进行染色以了解成骨细胞的骨形成，并且可以用抗酒石酸磷酸酶（TRAP）对骨组织进行染色以了解破骨细胞的骨吸收。如果您在同一部分上进行两次染色，则可以理解两者。另外，它具有的优点是，在脱钙的样本中，只要它可以被双重染色，就不需要特殊的设备，并且仅使用一般设备就可以容易地观察到骨代谢。在此前提下，我们需要研究二次染色的可行性。
二、骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色生产标准样品
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 碱性磷酸酶 | HC1779 | ||
| 2 | 蔗糖 | SS1498 | 57-50-1 | |
| 3 | 柠檬酸三铵 | LSH53568 | 7632-50-0 | |
| 4 | 福尔马林-EDTA脱钙液 | HC0733 |
染色研究
①第二次在没有福尔马林固定的情况下用酒精固定，ALP染色呈强阳性。 TRAP染色为阴性。 ②在福尔马林中固定16小时后，③在4天后，TRAP和ALP染色良好。但是，尽管福尔马林在1个月后固定的临床样本（骨软骨瘤）的TRAP染色呈阳性，但ALP不能染色。大鼠膝关节脱钙后的溶液溶解3天（Histra-DC，8?16℃）。 TRAP和ALP均不能染色。与此相反，中间柠檬酸盐脱钙溶液和最右边的EDTA脱钙溶液都可以使样品脱钙，以进行TRAP / ALP双重染色。
三．骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色中关于固定
ALP染色使用的是福尔马林不能固定的新鲜材料，因此，如果短时间内不固定，则会失去其酶活性。我们建议使用80％的酒精进行修复。请验证以下内容：
①第一次未固定小鼠的膝关节，第二次固定组直接浸入酒精中。
②用福尔马林（4％多聚甲醛溶液）第一次固定小鼠腰椎16小时后，用酒精进行第二次固定。
③用福尔马林第一次固定小鼠腰椎4天后，进行第二次固定。
④首次用福尔马林正式固定小鼠腰椎一个月后，进行第二次固定。
每组对TRAP和ALP进行双重染色，并测试染色是否可行。在该实验中，福尔马林可用于TRAP和ALP的双重染色，固定时间为16小时至4天。
四．骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色中关于脱钙
ALP是一种含有金属（Zn）的蛋白质。脱钙作用还将去除锌并导致酶失去活性。为了弥补这一缺点，添加了硫酸锌（ZnSO4）以激活ALP。每100 ml脱钙溶液添加0.4 ml 1％ZnSO4溶液以补充Zn。另外，在添加锌作为柠檬酸脱钙溶液缓冲液的同时，正在进行有关添加相同量的螯合剂EDTA溶液的相关研究。还研究了酸性脱钙溶液（福尔马林甲酸酯溶液）中的酶是否可以反应。结果表明，脱钙溶液如柠檬酸在EDTA溶液中染色良好。相反，在福尔马林甲酸盐溶液中不能对酶染色。另外，该脱钙方法是使用超声波脱钙装置（Histra-DC，普通光度法）在8-16℃的低温下连续运转3-6天以使样品脱钙。脱钙后，用甘氨酸和Veronal缓冲液（pH 7.4）洗涤，并使用磷酸钙吸附在组织上以防止沉淀。
五．骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色中关于染色
染色方法使用Lorch的Gomori方法。在该实验中，使用了同时使用偶氮染色法和偶联反应法的TRAP / ALP染色试剂盒（Wako Pure Chemicals，产品编号294-67001）。关于切片的厚度，Lorch建议使用8μm。同时，我还研究了普通的4μm切片是否可以染色，应先染色两次染色的顺序，TRAP和ALP的顺序，以及密封胶是否必须选择水溶性密封胶。染色法的结果是，在偶氮染色法中，如果切片太厚，则会有酶扩散，即骨基质的TRAP染色趋于红色。只要提高反应条件（反应温度和反应时间），甚至4 µm切片都可以完全染色。即，TRAP染色的反应温度为室温至37℃，反应时间为30分钟至45或60分钟。 ALP染色可在37°C下进行45分钟至3小时，或在室温下（10?15°C）进行，以将反应时间延长至一夜。最后，您可以获得平衡的色调和良好的染色效果。但是，增加反应条件将在ALP染色的部分上产生更多的颜料颗粒。 TRAP和ALP的染色顺序可以从任一侧开始。但是，当ALP进行TRAP染色时，阳性部分显示明显的红色，并且用新鲜的破骨细胞染色可以获得相对较好的标本。然而，由于TRAP溶液，ALP的反应产物产生白色混浊颗粒，其将沉淀在组织上。因此，TRAP染色后再进行ALP染色会更好。安装：甲基绿可以在几秒钟内用于染色核。洗涤后，将其在37°C下干燥，用二甲苯透明，并与屈大麻酚（Marinol）永久固定。有文献表明，在透明之前要使用酒精脱水，但这会导致反应产物浸出并扩散。将EDTA脱钙的1岁小鼠的腰椎石蜡切片用于TRAP / ALP双重染色。破骨细胞的TRAP染色为红色，细胞活性强的细胞（成骨细胞和软骨细胞）的ALP染色为棕色。 （顶部：弱扩展，底部：强扩展）
六、骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色中实验结论
每次固定，脱钙和染色后，经过一些改进后，可以使用TRAP和ALP酶对脱钙的石蜡标本进行染色。然而，酶扩散的现象，特别是在TRAP染色中，更为明显。有多种影响因素，主要是由于固定的影响。如果固定不充分，则在脱钙过程中可能容易出现问题，从而导致酶扩散现象。另外，必须注意脱钙本身的作用，即与未脱钙的试样相比，脱钙的试样观察到更多的扩散。这表明样品的脱钙很可能引起酶扩散。另外，还应考虑切片的厚度或两次染色的顺序。将来我们将朝这个方向进行研究。
