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小鼠骨髓细胞微核试验（介绍,原理,步骤,结论）
Release Time：2020-07-07一、小鼠骨髓细胞微核实验介绍
小鼠骨髓细胞微核实验中的微核是指存在于细胞主核之外的粒子，其大小相当于细胞直径的1/20至1/5。微核试验是一种快速检测化学毒物的方法，化学毒物会破坏染色体并干扰细胞的有丝分裂。它被认为是圆形或杏仁形，其染色与细胞核一致，并且在相间细胞中可以出现一种或多种。通常认为微核是细胞中的染色体断裂或纺锤体丝撞击，并在有丝分裂晚期停留在核外。因此，微核试验可以检测两种遗传学：由化学毒物或物理因素引起的染色体突变变化和染色体分离变化。结束。
微核可以出现在多种细胞中，但是在有核细胞中，将它们与正常细胞核的裂片和核突起区分开来更加困难。由于红细胞可以在成熟前最后一次分离后数小时排出主核，并且仍保留PCE细胞中的微核，因此通常要对PCE细胞中的微核进行计数。
二、小鼠骨髓细胞微核实验器械与试剂
| 序号 | 产品 | cas号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 甲醇 | 67-56-1 | JT25999 | |
| 2 | 甘油 | 56-81-5 | JT26018 | |
| 3 | 牛血清白蛋白96% | 9048-46-8 | SS2163 | |
| 4 | 生理盐水 | 7732-18-5 | ||
| 5 | 吉姆萨染料 |
51811-82-6 | SX0115 | |
| 6 | pH 6.8磷酸盐缓冲液 | HC1980 | ||
| 7 | 磷酸二氢钾 | 7778-77-0 | SS1343 | |
| 8 | 磷酸氢二钠 | 7558-79-4 | SS1345 |
1.设备手术刀，手术剪刀，无牙钳，弯曲小止血钳，干净的纱布，带橡胶头的移液器，台式离心机，离心分离管，胶片架，吹风机，玻璃蜡笔，玻璃染色筒，2ml注射器和针头，滑片和幻灯片，固定时钟，带油镜的显微镜，细胞计数器。
2.试剂甲醇（分析纯），甘油（分析纯），小牛血清，生理盐水和Giemsa储备溶液（取1g Giemsa染料，66ml和60ml甲醇。）先将染料放入研钵中，加少量将适量的甘油混合并研磨，然后将剩余的甘油分批浇注以继续研磨，然后将其转移到烧杯中，盖上玻璃观察杯，放置在60oC水浴中2h，取出冷却并加入混合甲醇，放置2周，用棕色过滤，储存在瓶中阴凉处。储存溶液储存的时间越长，染色效果越好。准备使用时，请使用pH 6.8磷酸盐缓冲液制备10％的应用溶液）和pH 6.8磷酸盐缓冲液。
（1）I / 15mol / L磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液：称取9.06g分析纯的KH2P04，溶于蒸馏水，使体积达到1000ml。
（2）1 / 15mol / L磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液：称取9.45 g解析纯Na2HPO4（或Na2HPO4·2H20 11.87g; Na2HPO4·7H20 17.87g; Na2HPO4·12H20 23.88g）溶解并用蒸馏水测定到1000ml。
4.pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液：取50.40 ml的l / 15mol / L磷酸二氢钾溶液和49.60ml的1 / 15mol / L磷酸氢二钠溶液。
5.阳性对照为环磷酰胺或丝裂霉素C。
三、小鼠骨髓细胞微核实验操作步骤
1.测试动物和治疗
（1）动物的选择：常用的实验动物是大型和小鼠。小鼠是使用最广泛的，需要18至20克体重和7至12周龄的体重。每组中的小鼠数量为10只，雌雄各占一半。
（2）中毒途径：根据研究目的或所测试化学毒物的性质，可选择口服，经皮，呼吸和注射途径。但原则上，应采用与人接触化学毒物相同的方式。
（3）中毒频率和采样时间：研究已经证实，化学毒物需要在目标器官中积累到一定浓度才能产生诱变作用。不同化学毒物诱导的微核的峰值时间也不同。波动范围可达24?72h。这就要求在接触化学毒物后建立不同的采样时间点。考虑到上述两个原因，建议使用多种曝光方法。其中，四次曝光更方便合理。也就是说，每天一次，连续4天，第5天采样。这样，样品可以覆盖24?72h的峰，并且如果峰延迟至96h，则不会错过。
（4）剂量选择：被测化学毒物的最大剂量应为最大耐受量，但溶解度极限除外。如果是叶子，应设定3至5个或更多剂量组。剂量范围应正确且连续。腹腔注射环磷酰胺（50?100mg / kg）或丝裂霉素C（10mg / kg）一次即可。或2次。 。静脉注射使用等体积的溶剂。
2.骨髓液的制备和涂片
在最后一次暴露测试动物后，在确定的时间通过颈脱位或麻醉处死它们。将四肢固定在解剖板上，用头发浸透腹部的中线，切开胸腹部，除去胸骨，并清洗血液。 ，去除肌肉，切断骨the，使用小的弯曲止血钳在干净的玻璃载玻片上挤入骨髓，并滴加小牛血清，混合均匀，然后推动载玻片。或者，在处死动物后，用手术剪刀除去股骨，除去肌肉，用生理盐水洗净血液和碎肉，切掉分离的骨physi，并使用带针的2ml注射器吸小牛血清。插入骨髓腔，将颗粒冲洗到离心管中，然后使用移液管吹动微观肿块以校正均匀性。以1000r / min的速度离心10分钟，弃去多余的上清液，并与沉淀物混合约0.5ml。用滴管吸出并将一滴滴在干净的玻璃载玻片上，然后推动载玻片。根据上述方法同时处理正电极和负电极。
3.固定
将干燥的骨髓切片放入染色槽中，用甲醇溶液固定15分钟，取出并干燥。无法及时染色的涂片也应固定并保存。
4.染色
固定和干燥后的涂片应重新准备。将Giemsa应用溶液（Giemsa储备溶液1份加pH 6.8磷酸盐缓冲液9份）染色10?15min，然后漂洗载玻片上的染色溶液，并放在架子上晾干。5.观察数
在低倍显微镜下观察，选择分布均匀且染色较好的区域，然后在油镜下计数。 PCE细胞为灰蓝色，阳性染色的红细胞（NCE）为橙色。细胞中所含的微核大多是圆形的，边缘光滑且整齐，发色团与核质一致，呈紫色或蓝紫色。一个或多个微核可以出现在细胞中。计算1000个PCE中包含微核的PCE数量，并计算200个细胞中PCE与NCE的比率。
四、小鼠骨髓细胞微核实验结论
本文仅计算PCE中的微核，微核率以千分之几表示。每只动物都是一个观察单位。计算每组雌雄动物的微核PCE平均值。当雌雄动物的性别没有明显差异时，可以将计算结果合并，否则应分开进行计算。正常的PCE / NCE比率约为1（正常范围为0.6?1.2）。如果该比率小于0.1，则意味着严重抑制了PCE的形成。一致的测试化学和正确的微核发生率的证据应与测试中使用的动物物种和品系的文献报道的结果或研究的历史数据相一致。
