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测序仪原理和方法（DNA测序仪,实验简介,实验步骤,注意事项,实验所需试剂）
Release Time：2020-07-29一、使用测序仪原理和方法实验简介：
基因检测过程中DNA序列测定，主要有两种不同测定方法，首先第一种是通过手动方法测序，其次第二种是通过仪器自动测序，手动测序方法目前常用的方法有两种，分别是Maxam-Gilbert化学降解的方法、Sanger双脱氧链终止的方法，目前采用自动测序方式的人趋多，自动测序已成为DNA序列分析的主流和未来趋势。
自动测序实验是采用新的毛细管电泳技术进行测序，该方式可以代替旧的聚丙烯酰胺板电泳方法，因此可以在PCR中采用单个引物测序反应中生成的PCR产物，是单链DNA混合物，在3末端的碱基差是1个碱基，因为含有的四种不同的荧光染料，因此可以采用对不同的四种荧光染料测序PCR产物进行毛细管电泳，以此避免泳道之间迁移率差异的给实验带来不利影响，最终达到减少实验误差的最终目的，通过自动测序的方法法可以大幅度的提高测序的准确性。
二、测序仪原理和方法实验步骤
1. PCR的测序反应
（1）首先拿出准备好的PCR试管0.2ml的，做好管体的编号工作后，将其插入沉淀冰中，并通过如下方式添加相关试剂：
| 名称 | 单位（μl） | 单位（μl） |
| BigDye Mix | 1 | 1 |
| 等待测定的质粒DNA | 1 | － |
| pGEM-3Zf（+）双链DNA | － | 1 |
| 等待测定的DNA正向引物 | 1 | － |
| M13（-21）引物 | - | 1 |
| 水（灭菌去离子） | 2 | 2 |
（2）将PCR试管放在PCR仪上进行扩增，在98℃的条件下变性2分钟后，开始进行PCR循环步骤。此步骤需要将PCR循环参数设置为时间共计10s，温度设置为96℃的条件下，时间共计5s，温度设置50℃的条件下，时间共计4min，温度设置60℃的条件下，最后总共需要经历25个循环和4℃的条件，用于扩增后的保温步骤。
2.通过使用乙酸钠或者是乙醇法纯化PCR产物
（1）取出完成上述步骤后所得的离心混合物，同时把经扩增后的产物转移到提前准备好的1.5ml EP管内。
（2）加入25μl乙酸钠或者是乙醇混合物，摇匀，在冰上放置10分钟以沉淀DNA。在4℃的条件下以12000 r / min离心30分钟，并小心弃去上清液。
（3）在所得离心沉定物中重复加入50μl的70％乙醇进行洗涤，洗涤步骤共计重复两次。再次进行离心，在4℃的条件下以12000r / min的速度离心5分钟，小心丢弃管壁上的上清液和液体珠，然后真空干燥沉淀10-15分钟。
3.电泳前对PCR产物进行测序。
（1）在离心管中加入12μlTSR，剧烈摇动以完全溶解DNA沉淀，然后短暂离心。
（2）将溶液转移至0.2ml PCR试管中，用盖子将其分开并稍稍离心。
（3）在PCR机上进行热变性（95℃的条件下 2分钟），在冰中将其淬灭，然后在机器上等待。
4.在计算机操作中，根据仪器操作手册安装毛细管，执行毛细管位置校正，手动填充胶水并建立运行中的序列文件。仪器将自动向毛细管中填充凝胶，进行1.2kV的预电泳5min，根据编程的顺序自动注入样品，之后开始进行预电泳步骤，此步骤需要将条件设置为1.2kV的条件下持续20min，之后继续调整试验条件，使等待测定的样品在7.5kV的条件环境下继续进行电泳步骤，此步骤需要持续2h，在电泳步骤结束后，仪器会自动开启清洗模式，继续填充凝胶步骤，之后输入下一个样品，继续重复进行预电泳和电泳步骤。注意更换的每个样品需要保证总电泳时间持续2.5h，电泳后，仪器将自动分析或打印出颜色顺序图。
5.仪器将自动执行序列分析，并可以根据用户要求比较序列，如果已知测序顺序，则可以通过序列比较将差异碱基标记为星号，以提高工作效率。
6.测序之后，需要做好所使用的仪器设备的日常的清洁和维护。
三、测序仪原理和方法实验注意事项：
1. 基因分析仪是一种高端精密仪器，需要专门设定固定人员进行操作，和日常的管理与维护。
2.本实验中测序PCR反应的总体积为5μl，没有被矿物油覆盖，因此PCR管帽的密封性非常重要，如果出现一下情况如加入试剂后PCR溶液少于4?4.5μl，则此PCR反应失败的可能性很大，后续的纯化和上样步骤可以停止不做了。
3.作为测序用户，需要提供的物品有引物和纯化后DNA样品。测序PCR反应中使用的不同模板需要不同量的DNA。 PCR测序所需的模板数量较少。一般来说，PCR产物需要30?90ng，单链DNA需要50-100ng，双链DNA需要200-500ng，DNA纯度一般为1.6-2.0 A260nm / A280nm，建议此实验过程中全部使用去离子水或三倍蒸馏水，用来溶解DNA，注意溶解DNA的步骤中尽量少用、最好不要使用TE缓冲溶液，同时溶解过程中3.2pmol /μl的引物也需要使用去离子水或三蒸馏水进行制备。
4.为了确保此测序实验的精准性，通过采用一种设计反向引物的方法，来相互确认同一模板进行的测序结果；可以手动检查N个碱基，有时可以区分它们，为了提高测序的准确性，根据星号指示的位置，可以手动分析该地点的颜色图，以进一步检查碱基。
四、实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 0.2mlPCR薄壁单管\透明\平盖 | F-EP002 | ||
| 2 | 0.2mlPCR薄壁单管\透明\平盖(灭菌) | F-EP002-H | ||
| 3 | DNA Polymerase I Large (Klenow Fragment) Kit 10X Taq Buffer(with Mg2+), for PCR |
SS1358 | 9012-90-2 | |
| 4 | 无菌去离子水 | HC1314 | ||
| 5 | 乙酸钠，三水 | JT0541 | 6131-90-4 | |
| 6 | 36%乙酸 | JT11990 | 64-19-7 | |
| 7 | 乙醇 | CCF12679 | 127852-29-3 | |
| 8 | 无水乙醇 | JT26000 | 64-17-5 |
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