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酶切的实验原理及步骤
Release Time：2020-07-21一、酶切实验实验方法和原理
酶切技术是采用了粘性末端连接时必须对目的DNA分子以及载体分子进行酶切对应的粘末端进行连接。
二，酶切实验所需的材料和试剂：
琼脂糖，水平电泳仪，微波炉或电炉，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴，紫外线透射仪，
1.5×TBE缓冲溶液。
2. 6x电泳上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，40％（w / v）蔗糖水溶液，在4°C下保存。3. 溴化乙锭（EB溶液的母液）：配制EB溶液 10mg / ml，并将其存储在用铝箔或黑纸包裹的容器中。
三，酶切实验的操作步骤：
1. DNA消化反应
①给ep管编号（最好为0.5ml），用微量移液管加入1μgDNA和2μl相应的核酸内切酶反应10x缓冲液，再加蒸馏水使总体积为19μl。将溶液在管中混合后，加入1μl酶溶液。用手指轻拂管壁以混合溶液。您也可以用微量离心机摇动它以将溶液浓缩在试管底部。此步骤是整个实验成功或失败的关键。有必要防止不正确的添加和遗漏。使用扩展核酸内切酶时，应将离开冰箱的时间减至最少，以避免活性降低。
②混合反应体系后，将eppendorf管放在适当的支架上（例如泡沫板上），并在37°C水浴中放置2-3小时以完成消化反应。
③在每个试管中加入2μl0.1mol / L EDTA（pH8.0），充分混合以终止反应，并保存在冰箱中以备后用。
2. 制备DNA分子量标准：使用DNA长度为50kb的双链DNA分子，商业溶液的浓度为0.5mg / ml，并且酶促水解反应如上所述。获得了八个片段，分别具有23.1、9.4、6.6、4.4、2.3、2.0、0.56和0.12kb的长度。 EcoRI切割了1个DNA，得到6个片段，长度分别为21.2、7.4、5.8、5.6、4.9和2.5 kb。
3. 制备琼脂糖凝胶过程
①取20ml 5×TBE缓冲溶液，加水至200ml，制备0.5×TBE缓冲溶液，备用。②胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，放入200ml锥形瓶中，加50ml 0.5×TBE代替缓冲液，放入烤箱（或电炉）中加热至琼脂糖全部融化，取把它摇匀。这是0.8％的琼脂糖凝胶溶液。在加热过程中不时摇动，使附着在瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时盖上密封膜以减少水的蒸发。
③橡胶板的准备：分开有机玻璃胶水箱，并用橡皮膏（宽度约1cm）将其密封。将密封的胶水箱放在水平支架上，插入样品梳，并观察到梳齿的下边缘应与胶水箱的底面保持约1毫米的间隙。将溴化乙锭添加到冷却至50-60℃的琼脂糖凝胶中（EB溶液转化的最终浓度为0.5μg/ ml（也可以不向凝胶中添加EB，而不必在电泳后使用0.5μg/ ml））EB溶液浸泡和染色）。用移液管吸取少量融化的琼脂糖凝胶密封胶糊，并在琼脂糖溶液固化后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶罐中，使胶形成均匀的胶层。浇注过程中的温度不能太低，否则固化会不均匀，速度不能太快，否则很容易出现气泡。凝胶完全固化后，拉出梳子，注意不要损坏梳子底部的凝胶，然后将0.5x TBE缓冲液添加到槽中，直到液位刚好在凝胶表面以下。由于边缘效应，样品池附近会出现一些隆起，防止缓冲液进入样品池，因此请注意确保样品池中要充满缓冲液。
4.样品的添加流程：取10μl酶促水解溶液和2μl6X上样溶液混合，小心地用微量移液器将其添加到样品罐中。如果DNA含量低，可以按照上述比例增加样品量，但是在将每个样品添加到总体积后应更换吸头，以防止相互污染。装入样品时要小心，以免损坏凝胶或样品罐。刺破底部凝胶。
5.电泳过程：添加样品后，关闭电泳槽的盖子并立即打开电源。控制电压保持在60-80V，电流大于40mA。当溴酚蓝带移至距凝胶前部约2 cm处时，电泳停止。
5.进行染色：电泳完成后，将无EB的凝胶板转移到0.5μg/ ml EB溶液中，在室温下染色20-25分钟。
6.拍照和进行观察：在长波紫外灯下，在254nm波长下染色或加入EB后，观察电泳胶板。 DNA的存在显示出橙红色荧光带，可以用肉眼区分。在紫光下观察时，在将近摄镜头和红色滤光镜添加到相机镜头后，将相机固定在相框上。使用全色胶片，光圈为5.6，曝光时间为10-120秒。 （根据荧光条的强度选择）。
7. DNA分子量标准曲线的制备：在放大的电泳照片上，以样品罐为起点，使用卡尺以厘米为单位测量EcoRI和HindⅢ消化的λDNA片段的迁移距离。使用核苷酸数的常用对数作为纵坐标，以迁移距离作为横坐标，在方格纸上绘制一条连接点的平滑曲线，这是电泳条件下DNA分子量的标准曲线。8. 确定DNA消化片段的大小：在放大的电泳照片上，使用卡尺测量DNA样品中每个片段的迁移距离。根据该值，进一步计算DNA分子量标准曲线上的对应对数值。分子量大小（如果使用单对数方格纸校准标准曲线，则可以根据迁移距离直接插入DNA片段的大小）。迁移距离。
9. 确定DNA消化片段的序列：根据单次消化，两次消化和多次消化的电泳分析结果，比较DNA消化片段大小的数据进行逻辑推理，然后确定分离顺序和相对每个限制位点的位置。以核苷酸图或直线图的形式，它是DNA分子的定向核酸内切酶图。
四、酶切实验需要注意的事项：
1. 消化过程中添加的DNA溶液的体积不能太大，否则DNA溶液中的其他成分会干扰酶的反应。
2. 酶活性通常以酶单位（U）表示。酶单位的定义是：在最佳反应条件下，在一小时内将1 mg lDNA完全降解的酶的量为一个单位，但在许多实验中制备的DNA不如lDNA容易。添加过量的酶是合适的到反应溶液中。除了成本方面的考虑，酶溶液中的微量杂质可能会干扰后续反应。
3. 市场上出售的酶通常浓度很高。为了经济起见，可以预先使用酶反应缓冲液（1x）。此外，该酶通常存储在50％的甘油中。在实验中，反应溶液中的甘油浓度应控制在1/10以下，否则会影响酶的活性。
4. 观察DNA与紫外线透射仪是分不开的，但是紫外线可以切割DNA分子。当从凝胶中回收DNA时，请尝试改变发光时间，并使用长波长紫外灯（300-360nm）减少紫外光对脱氧核糖核酸的裂解。
5. EB是一种强诱变剂，具有中等毒性。在准备和使用过程中应戴手套，并且EB不应洒在桌子或地面上。任何经过EB污染的容器或物品都必须经过特殊处理或最佳处理后进行清洁。
6. 当EB过多时，凝胶污渍太深，DNA条带不清晰，将凝胶加入蒸馏水中冲泡，然后在30分钟后观察。
五、酶切实验所需的试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | 1000ul蓝吸头 | FT-1000 | ||
| 2 | 200ul黄吸头 | FT-200 | ||
| 3 | Agarose | SF0014 | 9012-36-6 | |
| 4 | 溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 5 | 溴化乙锭 | SS1957 | 1239-45-8 | |
| 6 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | ||
| 7 | EDTA | WSH44880 | 65501-24-8 |
