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逆转录PCR实验
Release Time：2020-07-18逆转录RT-PCR实验是通过将RNA反转录(RT)和cDNA聚合酶链式扩增(PCR)相结合的一种生物技术。
一、实验步骤
①、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）；1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
②、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
③、试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
④、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、蒸溜水 1000ml、5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油、6×缓冲液，4℃保存
⑤、琼脂糖凝胶的配制：
1、1.0%： 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%： 同上，将琼脂糖的量改为1.5g
⑥、需购置的Rt-PCR材料：
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00
⑦、引物合成
1. 正义：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反义：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正义：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反义：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火温度计算：
2（A T） 4（G C）
正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、引物稀释：
加DEPC水量为（μl）= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
⑧、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
二、实验注意事项
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
三、实验所需仪器
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | 氯仿 | 75-62-7 | ||
| 2 | 硼酸 | JT0008 | 10043-35-3 | |
| 3 | Agarose | SF0014 | 9012-36-6 | |
| 4 | 异丙醇 | JG0098 | 67-63-0 | |
| 5 | 1000ul蓝吸头 | FT-1000 | ||
| 6 | 200ul黄吸头 | FT-200 | ||
| 7 | 2ml圆底连盖离心 | F-EP020 |
