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DNA连接（试验简介,实验步骤,实验方法,实验所需试剂）
Release Time：2020-07-18一、DNA连接试验简介：
DNA分子的体外连接是一个生化过程，其中DNA连接酶在一定条件下催化与两个双链DNA片段基团相邻的5'-端磷酸和3'-端羟基之间的磷脂键的形成，它是基于酶消化反应获得相同酶的互补序列。
必须将具有相同末端（平末端或粘性末端）的外源DNA片段克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应过程中，外源DNA和质粒都可以被环化，或形成串联寡聚物。因此，必须仔细调节连接反应中两个DNA的浓度以优化“正确的”连接输出量，但是碱性磷酸酶仍经常用于去除5'磷酸基团以抑制载体DNA本身。 T4 DNA连接酶用于在目标DNA片段和载体之间进行体外连接反应，即在5'磷酸双链DNA和相邻的3'胆固醇之间形成新的共价键，如果载体的两条链都带有5'磷酸（未脱磷），则可以形成4个新的磷酸二酯键；如果载体DNA已被去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，当时产生的重组DNA具有两个单链缺口，可将其引入感受态细胞后进行修复。
二、DNA连接试验所需材料及试剂：
1.苯酚、氯仿、TE（pH 7.6）溶液。
2.10×T4 DNA连接酶缓冲液（该缓冲液应分成小部分，并在-20°C下保存）：200mMTris-HCl（pH 7.6）；50mMMgCl2; 50mM二硫代苄糖醇。
3.500μl/ ml BSA（可用或不可用）。
4.5mMATP。
5.混凝剂：聚乙二醇、六氯化铵。
三、DNA连接试验步骤
（一）、预处理
1.将以下溶液添加到无菌的离心管中：
1）在体积为10μl的反应系统中：取50-100 ng的载体并添加一定比例的外源DNA分子（通常线性载体DNA分子与外源DNA分子的摩尔数为1：1至1 ：5）组成ddH2O至8μl。
2）轻轻混合，离心一点，然后在45°C水浴中融化重新连续的粘性末端5分钟，然后迅速将其转移到冰浴中。
3）加入1μl含ATP的10x缓冲液（T4 DNA连接酶的适当单位），并用ddH2O补足至10μl。
2.盖上管盖，混合均匀，并在台式离心机上离心五秒钟。
3.在12℃下碳化连接反应。
4.反应后储存在-20℃。
5.建立另外两个对照反应，其中仅包含（1）个质粒载体； （2）仅外源DNA片段。如果外源DNA的量不足，则每个连接反应可以使用50-100ng质粒DNA，并且可以同时添加更多的外源DNA，同时保持连接反应量不超过10μl。可以使用至少三种不同的方法来确定T4噬菌体DNA连接酶的活性。
（二）、平端连接（以20ul消化后的系统为例）
1.如果要填充或切平，请先将样品放入70度水浴中10分钟，然后将系统扩大至50ul。根据说明添加所需的klenow缓冲液和酶，BSA等。
2.在室温下反应10分钟后，将反应物放入37度水浴中，然后加入T4聚合酶反应5分钟。
3.用于凝胶回收处理的载体或杂质。
4. CIAP处理。
5.苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收。
6.连接反应。
四、DNA连接试验注意事项：
（一）、1.连接反应的温度：DNA连接酶的最佳反应温度为37°C，但在此温度下，粘性末端的氢键很容易，折衷方法在12°C的范围内。
2. DNA的平末端和粘性末端：由于核酸内切酶产生的DNA末端具有平末端和粘性末端，因此在连接反应中存在平末端和粘性末端连接，两者的连接效率不同，末端效率高，因此底物浓度和酶浓度的选择存在差异。
3.质粒载体的碱性磷酸酶处理：为了提高连接效率，通常应增加DNA的浓度，并应增加重组体的比例，这样，就会发生DNA自连接问题，因此通常用碱性磷酸酶处理质粒载体以去除其5'端的磷酸基团以防止环化，并且转化细胞后可以修复反应后形成的缺口。
4.连接反应的检测：连接反应的成功，最终的检测应通过随后的实验，宿主细菌的转化和阳性克隆的筛选来确定。
5.如果要检查连接酶和特定于连接酶的缓冲液是否有效，可以在消化后重新连接λDNA，如果连接成功，则说明有效。
（二）、平端连接的要求：
1. ATP浓度低（0.5mmol / L）。
2.没有诸如亚精胺的多胺。
3.很高浓度的连接酶（50Weiss units.ml）。
4.高浓度平端
（三）、聚胆固醇（PEG 8000）：
1.用去离子水配制的Peg8000储备溶液（40％）分成小份并冷冻保存，但应融化并达到添加水平，然后再加入连接反应混合物，在含有15％PEG 8000的连接反应混合物中，除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶外，所有其他连接的交替组分应在0°C混合，然后加入适当体积的PEG 8000（在室内）并充分混合，加入酶后于20°C孵育。
2.当连接包含0.5mmol / L ATP和5mmol / L MgCl2时，对连接响应的最大刺激作用最为明显，即使ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有下降，也会严重降低刺激强度。
3.浓度为15％的PEG 8000可以刺激具有粘性末端的DNA分子的连接效率提高10-100倍，反应的主要产物是串联连接剂。
4. PEG 8000可以刺激短至8个核苷酸的合成寡核苷酸的平末端连接，在这方面，它不同于氯化六氨合高钴。
（四）、氯化六氨合高钴：
1.用水制备六胺氯化高钴可制备10mmol / L的储存溶液，并在-20℃下储存。它对刺激连接反应具有很高的浓度可靠性，当连接反应混合物中的盐深度为1.0-1.5μmol/ L时，其刺激作用最大，六铵氯化钴高钴校正平端连接的效率提高到约50W，但端连接的效率只能提高五倍。
2.在存在一价阳离子（30 mmol/L KCl）的情况下，它对平端连接仍具有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布发生变化，连接产物不再是纯粹的分子间连接产物，相反，它被称为DNA，将尽其所能。
3.与PEG 8000不同，氯化六胺高钴不能显着提高合成寡核苷酸的连接速率。
（五）、1.插入片段和载体片段的比率要高。
2.要在连接酶上添加更多点，最好使用高浓度的酶。
3.载体被去磷酸化。
4. 15％PEG8000也可用于提高连接效率并减少载流子自链接。
5.反应系统为10UL，不要太大。
6.不要过多地进行载体透析，通常，进行消化并且将凝胶纯化和去磷酸化。加入0.5微升后，就足够了。
7.脱磷酸的步骤应根据酶的性质来确定，通常，反应需要一个小时，反应半小时后，补充酶，然后再反应半小时。
8.插入和载体毒性应被良好消化。
五、实验所需试剂清单：
| 1 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | |
| 2 | 2ml圆底连盖离心管(灭菌） | F-EP020-H | |
| 3 | 苯酚 | JT24025 | |
| 4 | 氯仿 | ||
| 5 | TE溶液 | HC2072 | |
| 6 | BSA | JT0982 | |
| 7 | T4 DNA连接酶缓冲液 | HC1398 | |
| 8 | Tris-HCl | HC2034 | |
| 9 | MgCl2 | JT2113 | |
| 10 | ATP | DBK500721 | |
| 11 | 聚乙二醇 | CG0346 | |
| 12 | 氯化铵 | JT10916 |
