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病毒斑实验知识解答
Release Time：2020-07-18一、实验介绍：
答：1.我这样做：
二、实验步骤
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 甲基纤维素 | 9004-67-5 | HC1131 | |
| 2 | 甲醛 | 100-52-7 | JT12059 | |
| 3 | 结晶紫 | 548-62-9 | SX0037 | |
| 4 | 碘液 | 7553-56-2 | HC0408 | |
| 5 | 乙醇95% | 64-17-5 | JT26000 | |
| 6 | 中性红 | 553-24-2 | FF0018 | |
| 7 | 琼脂 | 9002-18-0 | SW0006 |
1）24孔板预板
2）24小时后，弃去培养液，并用汉克斯溶液清洗一次
3）接种病毒溶液0.1ml /孔
4）放入37度5％CO2培养箱中1h，在此期间每15分钟缓慢摇动以充分吸收病毒
5）加入1％甲基纤维素（1ml /）覆盖培养基，将其放入37度5％CO2培养箱中以继续培养
6）3天后，吸出培养基
7）加入5％甲醛1ml /孔4min，弃去甲醛，加入结晶紫0.8ml /孔染色20min
8）用自来水缓冲液洗涤缓冲液以计算孔点的数量
2.我的老师也使用甲基纤维素进行菌斑测试，但浓度为2％。配置方法为：甲基纤维素：3克溶于150ml蒸馏水中，终浓度为2％;染色用碘溶液：将25g溶于500ml 95％乙醇。最终浓度为5％非常好。但是，甲基纤维素应预先放置较长时间，约2周，高压后放入冰箱，使用前请无菌添加培养液，混入冰箱中，一天后取出，剧烈摇动。 ，使纤维素食主义者达到均匀状态后，静置直至起泡完全消失。可以将染色液与0.1％（w / v）中性红色培养箱孵育2-3小时。如果是6孔板，则每孔加1ml。倒数后。
三、实验遇到的问题：
“ 1％甲基纤维素（1ml /）孔覆盖培养基，并将其放入37度5％CO2培养箱中以继续培养”是指将1％甲基纤维素直接添加到已放置培养基的孔中，或者甲基纤维素是否与培养基混合并添加到细胞中？配方比例是多少？甲基纤维素应提前很长时间准备，为什么要约2周？我什么时候可以数？标准是什么？
答：1. 1％甲基纤维素（1ml /）的孔覆盖介质应指添加1ml /孔的甲基纤维素覆盖的介质。甲基纤维素覆盖的介质应指粘性介质，这是一种特殊介质。简而言之，将甲基纤维素添加到普通细胞培养液中以提供粘度，而甲基纤维素应为非营养物质。因为甲基纤维素是不溶的，所以必须首先制备和消毒甲基纤维素溶液。然后在无菌条件下向其中添加其他培养基的所需成分。请注意，MEM配备有10倍，因此要添加的MEM溶液的体积要少得多。我根据协议制备了粘性介质，其最终总体积约为400 ml，因此10x MEM仅需40 ml。其他成分的量应根据400毫升培养基换算。因此，甲基纤维素和培养基没有分离，并且甲基纤维素仅是该培养基的成分。
至于何时可以计数，取决于感染后CPE的发生。这取决于特定的测试病毒。刚开始时，每天都要保持观察和计数。直到没有新的斑点出现，它应该在一周之内。一旦执行此操作，便可以弄清楚。
2.我也使用粘性介质进行噬菌斑实验。甲基纤维素覆盖的培养基的具体配方如下，以供参考：在玻璃瓶中，将8.8 g甲基纤维素（4000厘泊，Sigma）与320 ml蒸馏水混合。用大磁力搅拌器搅拌。在121℃高压灭菌30分钟，将磁力搅拌器留在瓶中。趁热将其从高压釜中取出并再次搅拌直至甲基纤维素完全溶解（通常数小时）。加入40 ml 10×MEM或10×DMEM，40 ml FBS，40,000 U青霉素，40 mg链霉素和4 ml 1 M HEPES。根据培养基供应商的建议添加L-谷氨酰胺和碳酸氢钠。 -20℃下保存6个月。配置此Viscous介质确实很麻烦。有很多试剂。甲基纤维素很难溶解，但根据上述方法，我大约在两三天内就将其溶解了。只要制备了甲基纤维素溶液，其他步骤就很简单。
问：我想问一下，无论使用哪种介质，如何消毒？如果使用高压，琼脂将在取出后立即凝固。如果在高温下添加，细胞将被烧死。琼脂在加热和溶解后会迅速固化。请指教。
答：可以使用低熔点的琼脂糖。压制后，将其保持在42度的孵育培养基中并保持在37度。在混合的半小时内不会固化。我所做的斑块实验使用的是低熔点琼脂糖，效果很好。当然，在文献中也建议这样做，因为我正在制作杆状病毒-昆虫表达系统，并且上盖仅防止病毒随液体传播。
