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RT-PCR实验
Release Time：2020-07-16一、RT-PCR实验简介：
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
二、RT-PCR实验所需材料及试剂：
EP管、离心机、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC水、溴化乙锭
三、RT-PCR实验步骤
（一）、总RNA提取
1.取200mg组织，将其放入1.5ml EP管中，加入1ml Trizol切碎。
2.震动30秒。
3.加入0.2ml氯仿，在室温下剧烈摇动30s 3分钟。
4. 12000×g，4℃离心15分钟。
5.吸出上层无色水相，并转移到另一个EP管（约0.5ml）中。
6.加入等体积的异丙醇，-20℃，30min。
7.在12000×g，4°C下离心10分钟，在试管底部可以看到微量的RNA沉淀
8.丢弃上清液，加入1ml的75％乙醇并摇匀。
9. 7500×g，在4℃下离心10分钟。
10.丢弃上清液，用滤纸小心吸收残留的液体，并在室温下干燥5-10分钟。
11.将沉淀物溶于20μlDEPC水中，取1μl，然后加入79μlDEPC水以测量OD260 / OD280
12.计算浓度和纯度，并保存在-70℃。
（二）、逆转录合成cDNA
快速混合并离心一次，冻存在-20℃冰箱冰柜中。
（三）、PCR反应
1.快速混合并离心一次，PCR产物在-20℃下保存。
2.取8μlPCR产物并加入5×上样缓冲液2μl2％琼脂糖凝胶电泳120V
3.100mA 30min溴化乙锭染色，凝胶成像仪成像和存储
四、实验所需试剂清单：
| 1 | 1.5ml尖底连盖高速离心管（灭菌） | F-EP015-H | |
| 2 | 异丙醇 | JT25997 | |
| 3 | 甲醇中三氯甲烷 | BDM000285 | |
| 4 | 溴化乙锭(EB) | SS1957 | |
| 5 | DEPC处理水 | HC1335 | |
| 6 | 乙醇 | JT26000 |
