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植物体内脱落酸、赤霉素的分离和测定实验
Release Time：2020-07-16一、脱落酸、赤霉素的分离和测定实验介绍
二、脱落酸、赤霉素的分离和测定实验原则
脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）可以溶解在有机溶剂（例如丙酮，甲醇）中进行萃取，并将粗提物进行一系列分离技术（例如萃取，薄层色谱法或纸色谱法）等）将ABA和GA与其他成分分开。然后从生物学或物理化学上鉴定纯化的ABA和GA。
（1）生物学鉴定1. ABA能抑制植物器官的生长。在某些浓度条件下，抑制程度与浓度成线性关系。使用该线性关系，可以确定组织中ABA的含量。 2. GA可以刺激幼小植物的节间伸长，特别是矮化植物的茎。在一定的浓度范围内，茎伸长与GA浓度呈线性关系。因此，可以根据茎的伸长来确定GA的含量。
（2）理化鉴定：可采用气相色谱法。
三、脱落酸、赤霉素的分离和测定材料，仪器和试剂
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 脱落酸 | 14375-45-2 | JH0488 | |
| 2 | 赤霉素 | 77-06-5 | HXH501769 | |
| 3 | 甲醇 | 67-56-1 | JT25999 | |
| 4 | 石油醚 | 8032-32-4 | SS6155 | |
| 5 | 乙酸乙酯 | 141-78-6 | JT11988 | |
| 6 | HCl | 2644-70-4 | ||
| 7 | 硅酸 | 1343-98-2 | LSH78385 | |
| 8 | 氯仿 | 865-49-6 | JW0132 | |
| 9 | 脱落酸 | 14375-45-2 | JH0488 | |
| 10 | 金属镓 | 7440-55-3 | JT2264 | |
| 11 | 乙醇 | 64-17-5 | JT26000 | |
| 12 | 正丁醇 | 71-36-3 | JT25998 | |
| 13 | 异丙醇 | 67-63-0 | JT25997 | |
| 14 | 氨水 | 1336-21-6 | JT8652 |
（1）材料：植物叶片，水稻种子和幼苗等；
（二）仪器：1.气相色谱仪； 2.分液漏斗； 3.组织匀浆器； 4.旋转蒸发干燥机； 5.色谱柱； 6. Huatman-3色谱纸； 7.微型注射器。
（C）试剂：1. 100％甲醇； 2. 80％甲醇； 3.石油醚； 4.乙酸乙酯； 5. 1mol / LHCl; 6.硅酸GF232； 7.氯仿； 8. GA； 9. ABA； 10.乙醇； 11.正丁醇； 12.异丙醇； 13. 3mol / L氨。
四、实验程序和结果计算
（1）脱落酸和赤霉素的提取分离
1.样品提取（1）取10g新鲜材料或存储材料（用100％甲醇固定，并置于-10°C冰箱中直至进行测试），切成小块，加入60ml预冷（<0°C） ＝ 80％甲醇溶液），均质5分钟，在4℃摇动（或搅拌）24小时均化液体，并过滤。然后将残余物与20 ml甲醇振摇1 h。重复两次，并混合滤液。 （2）滤液在旋转蒸发仪上干燥，减压（36?38℃）蒸发至原体积的一半，然后加入10ml石油醚提取部分色素，除去低级甲醇溶液，弃去甲醇。石油醚层，继续降低浓度并浓缩为水溶液。该水溶液包含IAA，ABA，GA和CTK等。
2.样品萃取用1 mol / L HCl调节水溶液的pH值至2.8至2.5。用等体积的乙酸乙酯作为水溶液萃取。将混合溶液装入分液漏斗中，并分离水相和乙酸乙酯相。取水相，用乙酸乙酯萃取两次。合并乙酸乙酯溶液。此时，CTK（细胞分裂素）存在于水相中，而ABA，GA和IAA存在于乙酸乙酯中。
3.样品的纯化（1）用旋转蒸发仪浓缩乙酸乙酯溶液至干。将残留物溶于2 ml 100％甲醇中。 （2）点样：取100μl甲醇溶液，将其放在涂有硅胶的GF254玻璃板的下端1cm处（或在Waterman No.3色谱纸上），然后在100μl标准GA和ABA溶液上点样。同一水平。 （3）铺展层：使用异丙醇-28％氨水-水（10∶1∶1，V / V / V）作为铺展剂铺展层。在0.5cm处停止从玻璃板的前边缘扩展到顶部。 （4）定位：色谱完成后，干燥玻璃板，并在紫外灯下观察碳带。与标准ABA和GARf具有相同或相似值的色带用作纯化的ABA和GA。 （5）洗脱：分别封闭ABA和GA谱带（或切割），并用95％乙醇萃取3次。溶液在减压下蒸发至干后，可以进一步用于生物学测量或气相色谱。
（2）ABA和GA的测定
1. ABA的生物学鉴定
（1）物质栽培：选择小麦种子，将种子在25℃的黑暗中浸泡2小时，将其放在培养皿中的湿滤纸上，然后在25℃萌发。胚根出现后，将其移至培养槽中的塑料网中，并继续在25°C的黑暗环境中进行培养。约72h后，选择胚芽鞘2.8-3.0cm的幼苗，用刀片从顶部切成3mm，5mm和5mm的三个部分，在中间切5mm并将其置于蒸馏水中2?3h 。
（2）制备ABA母液（200μg/ ml）：称取20 mg ABA，溶于少量酒精，并用去离子水稀释至100 ml。
（3）标准溶液的配制：取5ml母液，加非离子水补足至100ml，即10μg/ ml。移取5ml10μg/ ml ABA溶液，并用2％蔗糖-0.01mol / L磷酸盐缓冲液（pH 5.0）稀释至50ml，这是1μg/ ml ABA标准溶液。以此类推，分别制备了0、0.001、0.01、0.1和1μg/ ml的标准溶液。
（4）标准曲线图：将2ml各种浓度的ABA标准溶液分别放入10ml带塞的试管中，并在每管中加入10片小麦胚芽鞘。每个浓度需要3到4次重复。堵塞后，在25°C的黑暗处摇晃20小时。取出10个切段，测量其总长（cm），然后根据以下公式计算处理后的减少百分比（R）：R（％）=（D空D处理）/ D原件×100。
在公式中：D空：总空白长度； D治疗：总治疗时间； D原稿：原稿总长度（5.0厘米）。利用R和ABA浓度之间的相关性，绘制标准曲线。
（5）将待测样品溶于2ml 2％蔗糖-0.01mol / L磷酸盐缓冲液（pH5.0）的溶液中，然后进行栓塞测试，按照上述步骤，计算R值，然后检查标准曲线，得到ABA浓度C。根据下式计算样品中的ABA含量：ABA含量（μg/ g鲜重）= C（μg/ ml×2×10-1 / W（g））2. ABA气相色谱法测定洗脱的ABA加入0.1ml BSA（NO-二-三甲基甲硅烷基乙酰胺）使脱落酸甲硅烷基化，0.5h后吸取5μl气相色谱法色谱条件：柱长2m，φ5mm（不锈钢柱），固定固定相为SE-30，DMCS，A，W的10％，进样口温度250℃，柱温200℃，FID检测载气流速为30μl/ min，采用内标法，外标法定量。 ：ABA含量（μg/ g鲜重）= A1×Ws×100×1 /（As×5×W）。
