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SDS-PAGE工作原理
Release Time：2020-06-19 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）通常在实验室中用于基于分子量的蛋白质分离, 这是一种常用但尚未完全了解的技术。 因此，让我们尝试解决此问题。
SDS-PAGE根据蛋白质的分子量，根据它们在施加电场的作用下通过筛分基质（凝胶）的迁移速率的差异来分离蛋白质。
使蛋白质迁移率与分子量成比例
任何带电物质通过电场的运动都取决于其净电荷，分子半径和施加电场的大小。但是天然折叠的蛋白质的问题是它们的净电荷或分子半径都不是分子量依赖性的。取而代之的是，它们的净电荷是由氨基酸组成决定的，即蛋白质中正氨基酸和负氨基酸的总和以及蛋白质三级结构的分子半径。
因此，在其天然状态下，具有相同分子量的不同蛋白质将根据其电荷和3D形状在电场中以不同的速度迁移。
要仅根据蛋白质的分子量在电场中分离蛋白质，我们需要通过将蛋白质还原为线性分子来破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的来源。
SDS的作用（等）
SDS是一种存在于SDS-PAGE样品缓冲液中的去污剂，在其中与少量沸腾物和还原剂（通常是DTT或B-ME一起分解蛋白质-蛋白质二硫键）一起，会破坏SDS-PAGE的三级结构。蛋白质。这使折叠的蛋白质下降到线性分子。
SDS还用均匀的负电荷包被蛋白质，从而掩盖了R-基团上的固有电荷。 SDS与线性蛋白质相当均匀地结合（大约1.4g SDS / 1g蛋白质），这意味着蛋白质的电荷现在大约与其分子量成正比。
SDS也存在于凝胶中，以确保蛋白质线性化并掩盖电荷后，在整个运行过程中保持这种状态。
确定SDS涂层蛋白的主要因素是其分子半径。已显示SDS包被的蛋白质是线性分子，宽18埃，长度与分子量成正比，因此分子半径（以及因此在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不会存在基于电荷的差异迁移。
凝胶基质
在施加的电场中，经SDS处理的蛋白质现在将根据其分子量以不同的速率移向正极。由于凝胶基质的高摩擦环境，这些不同的迁移率将被夸大。
顾名思义，用于SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺，这是一个很好的选择，因为它是化学惰性的，并且至关重要的是，可以很容易地以各种浓度配制以产生不同的孔径，从而提供各种分离条件可以根据您的需要进行更改。您可能还记得我之前写过一篇有关丙烯酰胺聚合机理的文章。
间断缓冲系统和堆积凝胶-在起跑线上将它们衬里
为了通过凝胶将电流从阴极（负极）传导到阳极（正极），显然需要缓冲液。通常，我们使用不连续的Laemmli缓冲系统。 “不连续”仅表示凝胶和槽中的缓冲液不同。
典型地，该系统设置有用Tris-HCl缓冲的pH 6.8的堆积凝胶，用Tris-HCl缓冲的pH 8.8的流动凝胶和pH 8.3的电极缓冲液。堆积凝胶具有低浓度的丙烯酰胺，而流动凝胶具有较高的浓度，能够阻止蛋白质的运动。
那么，所有这些不同的pH值是什么？
好吧，取决于pH值，甘氨酸可以三种不同的电荷状态存在：正电荷，中性电荷或负电荷。如下图所示。通过不同的缓冲液控制甘氨酸的电荷状态是整个堆叠凝胶的关键。
这就是堆积凝胶的工作原理。打开电源后，pH 8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入pH为6.8的堆积凝胶。在这种环境下，甘氨酸主要转换为两性离子（中性电荷）状态。这种电荷的损失使它们在电场中的移动非常缓慢。
另一方面，Cl-离子（来自Tris-HCl）在电场中的移动要快得多，它们形成的离子前沿在甘氨酸之前迁移。 Cl-与Tris抗衡离子（现在正向阳极移动）的分离产生了一个狭窄区域，该区域具有陡峭的电压梯度，将甘氨酸沿其拉向后面，从而导致迁移离子的两个狭窄分离的前沿；高流动性的Cl-前沿，然后是较慢的（主要是中性的）甘氨酸前沿。
凝胶样品中的所有蛋白质的电泳迁移率介于甘氨酸和Cl-的极值之间，因此，当两个前沿扫过样品孔时，蛋白质都集中在Cl之间的狭窄区域-和甘氨酸前沿。
而且他们离开了！
该过程一直进行到撞到运行中的凝胶为止，此时pH值切换为8.8。在此pH值下，甘氨酸分子大部分带负电，并且迁移速度远快于蛋白质。因此，甘氨酸前沿加速通过蛋白质，将它们留在灰尘中。
结果是蛋白质在堆积和流动凝胶的界面处以非常窄的条带倾倒，并且由于流动凝胶具有增加的丙烯酰胺浓度，这会根据蛋白质的大小减慢蛋白质的移动，因此开始分离。
这是怎么回事？
如果您仍然想知道为什么需要堆积凝胶，请考虑一下如果不使用它，会发生什么。
凝胶孔大约1厘米深，您通常需要充分填充它们以使凝胶上有足够的蛋白质。因此，在没有堆积凝胶的情况下，您的样品会以高达1厘米深的条带坐在流动凝胶的顶部。
而不是排成一列并撞到电泳胶，这意味着样品中的蛋白质将在不同的时间全部进入电泳胶，从而产生非常模糊的条带。
因此，堆积凝胶可确保所有蛋白质同时到达运行凝胶，因此分子量相同的蛋白质将以紧密的条带迁移。
分离
一旦蛋白质进入电泳，它们就会被分离，因为分子量较高的蛋白质通过多孔丙烯酰胺凝胶的速度比分子量较低的蛋白质要慢。可以通过更改丙烯酰胺的浓度，根据要分离的蛋白质的大小来更改凝胶中的孔的大小。典型值如下所示。
对于较宽的分离范围，或者对于难以分离的蛋白质，可以使用梯度凝胶，该梯度凝胶具有增加的丙烯酰胺浓度层。
SDS-PAGE根据蛋白质的分子量，根据它们在施加电场的作用下通过筛分基质（凝胶）的迁移速率的差异来分离蛋白质。
使蛋白质迁移率与分子量成比例
任何带电物质通过电场的运动都取决于其净电荷，分子半径和施加电场的大小。但是天然折叠的蛋白质的问题是它们的净电荷或分子半径都不是分子量依赖性的。取而代之的是，它们的净电荷是由氨基酸组成决定的，即蛋白质中正氨基酸和负氨基酸的总和以及蛋白质三级结构的分子半径。
因此，在其天然状态下，具有相同分子量的不同蛋白质将根据其电荷和3D形状在电场中以不同的速度迁移。
要仅根据蛋白质的分子量在电场中分离蛋白质，我们需要通过将蛋白质还原为线性分子来破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的来源。
SDS的作用（等）
SDS是一种存在于SDS-PAGE样品缓冲液中的去污剂，在其中与少量沸腾物和还原剂（通常是DTT或B-ME一起分解蛋白质-蛋白质二硫键）一起，会破坏SDS-PAGE的三级结构。蛋白质。这使折叠的蛋白质下降到线性分子。
SDS还用均匀的负电荷包被蛋白质，从而掩盖了R-基团上的固有电荷。 SDS与线性蛋白质相当均匀地结合（大约1.4g SDS / 1g蛋白质），这意味着蛋白质的电荷现在大约与其分子量成正比。
SDS也存在于凝胶中，以确保蛋白质线性化并掩盖电荷后，在整个运行过程中保持这种状态。
确定SDS涂层蛋白的主要因素是其分子半径。已显示SDS包被的蛋白质是线性分子，宽18埃，长度与分子量成正比，因此分子半径（以及因此在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不会存在基于电荷的差异迁移。
凝胶基质
在施加的电场中，经SDS处理的蛋白质现在将根据其分子量以不同的速率移向正极。由于凝胶基质的高摩擦环境，这些不同的迁移率将被夸大。
顾名思义，用于SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺，这是一个很好的选择，因为它是化学惰性的，并且至关重要的是，可以很容易地以各种浓度配制以产生不同的孔径，从而提供各种分离条件可以根据您的需要进行更改。您可能还记得我之前写过一篇有关丙烯酰胺聚合机理的文章。
间断缓冲系统和堆积凝胶-在起跑线上将它们衬里
为了通过凝胶将电流从阴极（负极）传导到阳极（正极），显然需要缓冲液。通常，我们使用不连续的Laemmli缓冲系统。 “不连续”仅表示凝胶和槽中的缓冲液不同。
典型地，该系统设置有用Tris-HCl缓冲的pH 6.8的堆积凝胶，用Tris-HCl缓冲的pH 8.8的流动凝胶和pH 8.3的电极缓冲液。堆积凝胶具有低浓度的丙烯酰胺，而流动凝胶具有较高的浓度，能够阻止蛋白质的运动。
那么，所有这些不同的pH值是什么？
好吧，取决于pH值，甘氨酸可以三种不同的电荷状态存在：正电荷，中性电荷或负电荷。如下图所示。通过不同的缓冲液控制甘氨酸的电荷状态是整个堆叠凝胶的关键。
这就是堆积凝胶的工作原理。打开电源后，pH 8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入pH为6.8的堆积凝胶。在这种环境下，甘氨酸主要转换为两性离子（中性电荷）状态。这种电荷的损失使它们在电场中的移动非常缓慢。
另一方面，Cl-离子（来自Tris-HCl）在电场中的移动要快得多，它们形成的离子前沿在甘氨酸之前迁移。 Cl-与Tris抗衡离子（现在正向阳极移动）的分离产生了一个狭窄区域，该区域具有陡峭的电压梯度，将甘氨酸沿其拉向后面，从而导致迁移离子的两个狭窄分离的前沿；高流动性的Cl-前沿，然后是较慢的（主要是中性的）甘氨酸前沿。
凝胶样品中的所有蛋白质的电泳迁移率介于甘氨酸和Cl-的极值之间，因此，当两个前沿扫过样品孔时，蛋白质都集中在Cl之间的狭窄区域-和甘氨酸前沿。
而且他们离开了！
该过程一直进行到撞到运行中的凝胶为止，此时pH值切换为8.8。在此pH值下，甘氨酸分子大部分带负电，并且迁移速度远快于蛋白质。因此，甘氨酸前沿加速通过蛋白质，将它们留在灰尘中。
结果是蛋白质在堆积和流动凝胶的界面处以非常窄的条带倾倒，并且由于流动凝胶具有增加的丙烯酰胺浓度，这会根据蛋白质的大小减慢蛋白质的移动，因此开始分离。
这是怎么回事？
如果您仍然想知道为什么需要堆积凝胶，请考虑一下如果不使用它，会发生什么。
凝胶孔大约1厘米深，您通常需要充分填充它们以使凝胶上有足够的蛋白质。因此，在没有堆积凝胶的情况下，您的样品会以高达1厘米深的条带坐在流动凝胶的顶部。
而不是排成一列并撞到电泳胶，这意味着样品中的蛋白质将在不同的时间全部进入电泳胶，从而产生非常模糊的条带。
因此，堆积凝胶可确保所有蛋白质同时到达运行凝胶，因此分子量相同的蛋白质将以紧密的条带迁移。
分离
一旦蛋白质进入电泳，它们就会被分离，因为分子量较高的蛋白质通过多孔丙烯酰胺凝胶的速度比分子量较低的蛋白质要慢。可以通过更改丙烯酰胺的浓度，根据要分离的蛋白质的大小来更改凝胶中的孔的大小。典型值如下所示。
对于较宽的分离范围，或者对于难以分离的蛋白质，可以使用梯度凝胶，该梯度凝胶具有增加的丙烯酰胺浓度层。
| 序号 | 产品名 | 货号 | PH值 | |
| 1 | SDS-PAGE分离胶缓冲液 | HC1294 | ||
| 2 | SDS-PAGE蛋白加样缓冲液,5× | HC1297 | ||
| 3 | SDS-PAGE浓缩胶缓冲液 | HC1293 | ||
| 4 | SDS-PAGE蛋白加样缓冲液 | HC1289 | ||
| 5 |
