---

荧光显微镜简介：
荧光显微镜是光学显微镜的一种特殊形式。 它利用荧光染料被一定波长的光激发后发光的能力。 感兴趣的蛋白质可以通过抗体染色或用荧光蛋白标记用这种荧光染料进行标记。 它允许确定单个分子种类的分布、其数量及其在细胞内的定位。 此外，可以进行共定位和相互作用研究，使用可逆结合染料观察离子浓度，例如 观察到 Ca2+ 和 fura-2，以及内吞作用和胞吐作用等细胞过程。 今天，甚至可以借助荧光显微镜对亚分辨率粒子进行成像。

---

斯托克斯频移
荧光的一个重要特征是斯托克斯频移。它描述了激发光子和发射光子的能级差异。荧光染料发射的光子比激发光子具有更大的波长。这是由于在荧光染料被激发之后但在其发射光子之前向周围环境释放能量。由此产生的波长偏移使得区分激发光和发射光成为可能。能量的吸收和发射可以看作是分子种类的特定特征。

---

荧光显微镜
荧光显微镜（正置或倒置）类似于普通光学显微镜，不同之处在于照明由激光作为单色光或明亮且强大的光源（如汞蒸汽或氙弧灯）提供。此外，它还包含一个激发滤光片和一个发射滤光片。激发滤光片仅传输能够用其特定染料激发样品的光。样品发出的光在到达检测器之前必须通过发射滤光片。发射滤光片仅对具有不同波长的光是半透明的，例如样品发出的光。

1. 荧光显微镜的光通路

---

近年来，LED（发光二极管）也被用作荧光显微镜的光源。 LED 发出的光的波长取决于用于生产的材料。 然而，在大多数情况下都需要激发滤光片，因为 LED 通常会在相当宽的波长范围内发光。
大多数荧光显微镜是落射荧光显微镜。 照明器和物镜位于样品的同一侧，光线不会穿过样品。 除了激发和发射滤光片外，这种荧光显微镜还需要一个分色镜。 分色镜允许特定波长的光通过，而其他波长的光被反射。 滤光片和分色镜通常一起插入滤光片立方体中。

2. 滤波器原理

---

激发光通过激发滤光片并被引导至分色镜。这会将通过物镜的光反射到样品上。样品中的荧光染料被激发并发射光子。该发射光通过物镜返回到分色镜。发射的光具有适当的波长并且能够通过。被试样反射的激发光不能通过分色镜，会被挡住。如果激发光能够通过二向色镜，它会在到达发射滤光片时被阻挡。可以用检测器测量通过发射滤光片的光。
荧光显微镜中使用了不同类型的滤光片。可以区分带通、长通和短通滤波器。带通滤光片传输一个波长带，而波长更大或更小的光将被阻挡。长通和短通滤波器是边缘滤波器。长通滤光片传输长波长的光。波长高于某个截止值的光将无法通过。相反，短通滤光片传输短波长并阻挡长波长。

---

不同的荧光显微镜中技术
荧光显微镜被广泛使用并提供了很好的特异性。各种技术可以解决不同的问题，甚至可以绕过 Ernst Abbe 描述的衍射极限。
分子种类的定位可以通过细胞器的共染色来确定，例如细胞器。细胞骨架或细胞膜。共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 可以在没有来自焦平面外部的信号的情况下观察样本中的区域，并允许进行光学切片。全内反射 (TIRF) 显微镜是一种允许观察靠近细胞表面的薄区域的技术。渐逝场激发该区域的荧光染料。
一种观察分子种类动力学的技术是光漂白后的荧光恢复 (FRAP)。限制区域中的荧光染料被光漂白，并且可以测量未漂白分子扩散到该区域中的情况。可以使用荧光能量转移 (FRET) 显微镜进行相互作用研究。激发的供体生色团可以将能量转移到受体荧光染料并激发它。这只有在两者非常紧密地结合在一起时才有可能。如果这些染料与不同的蛋白质偶联，它们只有在蛋白质相互作用时才能传递能量并发出荧光。
允许亚分辨率图像的技术是受激发射耗尽 (STED) 显微镜、基态耗尽 (GSD) 显微镜、单分子和基态耗尽显微镜，然后是单个分子返回 (GSDIM)，以及光激活定位显微镜 (PALM) 和随机光学重建显微镜（STORM）。用于这些技术的亚分辨率显微镜也被称为纳米显微镜，因为它们在纳米尺度上解析图像。

---

5.Pukinje细胞，小鼠小脑皮质的三重标记旁矢状切面。 红色：anti-calbindin-D28k/Cy3，绿色：anti-GFAP/Cy5，蓝色：Hoechst 33258

---