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DNA和RNA纯化方法
Release Time：2022-09-20DNA和RNA纯化方法:您是否正在建立一个新实验室并想知道您需要什么来纯化 DNA 和 RNA？ 或者您是否发现您的样品对于您的下游应用来说不够纯净？
与核酸提取相比，DNA 和 RNA 纯化不包括任何破坏细胞膜和释放核酸的裂解步骤。 相反，它涉及您的样品的清理，例如 有效去除所有在 PCR 过程中用于促进目标序列扩增的成分。
1. 乙醇和异丙醇沉淀
我们将仔细研究的第一种纯化方法是乙醇和异丙醇沉淀。这是纯化基因组 DNA 的首选方法，可用于在 CsCl 密度梯度离心与 EthBr、苯酚-氯仿提取、消化和 PCR 等应用后浓缩和脱盐核酸样品。
1.1 它的工作原理？
乙醇和异丙醇沉淀都与溶解度有关。水和核酸都是极性分子，这就是DNA和RNA容易溶于水的原因。要沉淀它们，您可以使用乙醇或异丙醇。
对于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入两倍体积的冰冷的 96% 乙醇和盐（通常是乙酸钠）。乙醇降低介电常数，使糖磷酸骨架上的负电荷被乙酸钠的 Na+ 离子中和。由于核酸现在的亲水性降低，当您在冰上孵育混合物时，它们会从溶液中脱落。然后离心您的样品以将核酸与其他核酸分离，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何残留的盐分。再次离心样品，去除乙醇，让核酸沉淀干燥，然后将其重新悬浮在干净的水性缓冲液中。
要干燥核酸沉淀，您可以将试管（打开盖子）放在层流罩几个小时，或使用真空离心机。您选择的方法取决于您，但您必须确保颗粒完全干燥，以避免残留的乙醇对您的下游应用产生负面影响。
异丙醇沉淀非常相似。唯一的区别是您可以跳过冰上孵育步骤，并在第一步中用室温异丙醇代替冰冷的乙醇。关于异丙醇的体积，等于样品体积的量就足够了。
乙醇还是异丙醇更合适取决于您的样品体积、浓度和核酸片段的大小。如果您有大量样品，可能无法将两倍样品体积的乙醇加入试管中。异丙醇沉淀对于较大核酸片段和较低样品浓度的沉淀也是优选的，因为核酸在异丙醇中的溶解度较低。最重要的是，异丙醇沉淀是更快的方法，因为您不需要在离心前孵育您的样品。
1.2 优缺点
乙醇和异丙醇沉淀根本不昂贵，因为乙醇、异丙醇和乙酸钠非常便宜，并且该过程提供了高纯度核酸的良好收率。然而，这是一个非常耗时的过程，并且由于需要手动执行，因此变化很大。因此，低再现性可能是一个问题。
1.3 所需设备
乙醇或异丙醇沉淀所需的只是离心机和层流罩，或真空离心机来干燥颗粒。
2. 凝胶电泳和离心柱纯化
由于凝胶电泳根据核酸长度分离核酸，因此您可以使用此方法将感兴趣的核酸与其他核酸类型和污染物分离。
2.1 它是如何工作的？
首先，您需要运行凝胶。有关如何进行琼脂糖凝胶电泳的更多详细信息，请参阅我们关于核酸定量和可视化的文章的第 1 节。
可视化凝胶后，使用锋利的手术刀切除感兴趣的核酸条带。 在此步骤中，请始终记住佩戴适当的 PPE（面罩和手套），尤其是在使用紫外线来显示您的乐队时。 然后，使用合适的离心柱纯化试剂盒从 TAE 或 TBE 缓冲琼脂糖凝胶中纯化核酸条带。 由于可用的各种套件彼此略有不同，因此您应仔细遵循制造商的说明。 通常，您需要称量核酸条带的重量，每 100 mg 凝胶切片添加指定量的缓冲液，然后加热混合物以溶解琼脂糖。然后将样品转移到离心柱并纯化核酸 酸使用结合、洗涤和洗脱步骤。 有关离心柱协议如何工作的更多详细信息，请参阅我们关于核酸提取的文章的第 2.2.2.1 节。
2.2 优缺点
这种核酸纯化方法的巨大优势在于琼脂糖不会使核酸变性，因此很容易从凝胶中回收它们而不会造成任何伤害。但是，它不适合高通量实验室，因为运行凝胶非常耗时，并且仅限于少量样品。
2.3 所需设备
与其他纯化方法相比，此工作流程需要许多不同的仪器。琼脂糖凝胶电泳需要凝胶电泳系统、外部电源和生物安全柜，因为您将使用危险的嵌入染料。离心柱纯化要求不高，因为您只需要一台离心机。
3. 离心柱纯化
离心柱不仅用于从裂解样品中提取核酸，还用于纯化它们，例如在 PCR 反应后去除可能抑制后续应用的盐、酶、引物、引物二聚体和核苷酸。
3.1 它是如何工作的？
如上所述，离心柱纯化方案包括结合、洗涤和洗脱步骤。将样品转移到离心柱中后，将它们离心以将核酸结合到柱内的膜上。这允许不需要的组件通过。使用洗涤缓冲液的几个额外的离心步骤去除残留的不需要的材料，使用洗脱缓冲液的最后离心步骤将核酸从膜中释放出来。
3.2 优缺点
如您所见，这种纯化方法既快速又简单。最重要的是，它可以适应您的样品数量，因为您也可以使用 96 孔硅胶膜板代替单离心柱。但是，膜可能会堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脱体积，因此您可能会得到相当低的核酸浓度。
3.3 所需设备
离心柱纯化所需的唯一设备是离心机，除非您使用 96 孔格式并更喜欢使用带泵的真空歧管，这也是可能的。
4. 磁珠纯化
就像离心柱一样，磁珠既可用于从裂解样品中提取核酸，也可用于纯化。例如，您可以使用磁珠从 PCR 产物中去除盐、酶、引物、引物二聚体和核苷酸，否则会抑制后续应用。
4.1 它是如何工作的？
使用磁珠的纯化工作流程与提取工作流程非常相似。您首先添加将核酸结合到样品上的磁珠。
然后将试管放在磁铁上，去除含有不需要的未结合物质的上清液。您重复此步骤几次，在其间更换洗涤缓冲液。最后，您添加洗脱缓冲液并将样品转移到不同的容器中。
与使用磁珠的提取方案相比，在纯化过程中只有特定长度的核酸片段与磁珠结合。这种尺寸排阻机制是通过为感兴趣的核酸片段创造完美的结合条件，通过改变缓冲液、盐和它们的浓度以及因此的亲水性/疏水性来实现的。
4.2 优缺点
磁珠纯化的一个巨大优势是可以根据您的预算选择所需的设备。
选项 1：获取磁性支架并手动执行工作流程。这是最便宜的选择，但也是最乏味和最容易出错的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因为这会导致样品损失。
选项 2：对于高通量应用，您还可以购买台式移液机器人，或 96 或 384 通道移液器。这些设备减少了手动液体处理步骤，提高了生产率和可重复性，也可用于其他应用。有关如何将此类设备用于磁珠纯化的更多信息，请访问我们关于使用 MACHEREY-NAGEL 的 NucleoSpin® 96 质粒试剂盒进行质粒 DNA 纯化、使用 Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 ASSIST PLUS 进行 PCR 纯化以及使用Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 VIAFLO 96。
选项 3：通过购买专用纯化系统自动化整个工作流程。
磁珠纯化的另一个方便之处在于，您可以使用比旋转柱纯化更低的洗脱体积，而且它更易于扩展，因为您可以将它与 384 孔板一起使用。
4.3 所需设备
如前所述，您可以将磁珠纯化设备与您的预算相匹配。如果预算有限，可以购买磁性支架，如果有更多资金，可以购买台式移液机器人或 96 或 384 通道移液器，或者使用专用的纯化系统。
5.Sephadex® 纯化
Sephadex 纯化可用于从较小的分子中纯化核酸，例如引物、核苷酸或染料。
5.1 它是如何工作的？
Sephadex 是一种凝胶过滤树脂，由环氧氯丙烷交联的葡聚糖制成。5 要制备树脂，您需要将 Sephadex 粉末添加到离心柱中，用水再水合，然后离心柱以去除多余的水。在第二次旋转色谱柱之前，将样品添加到树脂顶部。在离心过程中，较大的分子很容易通过树脂并洗脱，而较小的分子会被困在葡聚糖珠的孔隙中。微珠的尺寸排除能力取决于您选择的 Sephadex 类型。例如，Sephadex G-25 Medium5可用于纯化分子量>5000的核酸，G-50 Medium6适用于分子量>30000的分子。
为了加快这一工作流程，请选择预装 Sephadex 的离心柱，而不是自己创建它们，或者在 96 孔过滤板中工作。
5.2 优缺点
就像离心柱纯化一样，该方法可以根据您的通量需求进行调整，方法是在离心柱或 96 孔滤板中进行。不存在分子-基质结合步骤还可以防止对核酸造成不必要的损伤，7 使其成为一种相当温和的纯化方法。然而，这非常耗时，尤其是在您自己准备离心柱或过滤板时——Sephadex 必须再水合大约三个小时——而且不能自动化。
5.3 所需设备
Sephadex 纯化所需的唯一设备是离心机。
6. 酶促方法
如果您的后续应用，一些制造商会提供酶法来清理您的 PCR 产物——例如Sanger 测序、下一代测序或 SNP 分析——要求您的样品不含未掺入的引物和 dNTP。
6.1 它是如何工作的？
酶促方法仅包括两个步骤。首先，将酶混合物添加到样品中，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。在孵育过程中，混合物中的第一种酶，核酸外切酶 I，将消化多余的引物，第二种酶，碱性磷酸酶，将去磷酸化 PCR 期间未消耗的 dNTP。酶发挥作用后，您可以将样品加热到 80 °C 再加热 15 分钟以使酶失活。
6.2 优缺点
除了快速简便之外，此方法不会导致样品损失，并且可以轻松适应您的样品数量。它唯一的缺点是它只能用于从引物和 dNTPs 中清除 PCR 产物，而不能去除任何其他 cont
7. 结论
如您所见，每种样品类型、下游应用和预算都有一种核酸纯化方法。 我们希望本文能帮助您确定选择哪一个来满足您的特定需求。
如果您来这里不仅是为了了解核酸纯化的技巧，您可能还想了解收集样本、提取核酸、执行 PCR 反应和量化核酸所需的知识。 当我们正在装备一个新的内部实验室时，我们整理了这个由五部分组成的系列，现在看起来像这样：
与核酸提取相比，DNA 和 RNA 纯化不包括任何破坏细胞膜和释放核酸的裂解步骤。 相反，它涉及您的样品的清理，例如 有效去除所有在 PCR 过程中用于促进目标序列扩增的成分。
1. 乙醇和异丙醇沉淀
我们将仔细研究的第一种纯化方法是乙醇和异丙醇沉淀。这是纯化基因组 DNA 的首选方法，可用于在 CsCl 密度梯度离心与 EthBr、苯酚-氯仿提取、消化和 PCR 等应用后浓缩和脱盐核酸样品。
1.1 它的工作原理？
乙醇和异丙醇沉淀都与溶解度有关。水和核酸都是极性分子，这就是DNA和RNA容易溶于水的原因。要沉淀它们，您可以使用乙醇或异丙醇。
对于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入两倍体积的冰冷的 96% 乙醇和盐（通常是乙酸钠）。乙醇降低介电常数，使糖磷酸骨架上的负电荷被乙酸钠的 Na+ 离子中和。由于核酸现在的亲水性降低，当您在冰上孵育混合物时，它们会从溶液中脱落。然后离心您的样品以将核酸与其他核酸分离，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何残留的盐分。再次离心样品，去除乙醇，让核酸沉淀干燥，然后将其重新悬浮在干净的水性缓冲液中。
要干燥核酸沉淀，您可以将试管（打开盖子）放在层流罩几个小时，或使用真空离心机。您选择的方法取决于您，但您必须确保颗粒完全干燥，以避免残留的乙醇对您的下游应用产生负面影响。
异丙醇沉淀非常相似。唯一的区别是您可以跳过冰上孵育步骤，并在第一步中用室温异丙醇代替冰冷的乙醇。关于异丙醇的体积，等于样品体积的量就足够了。
乙醇还是异丙醇更合适取决于您的样品体积、浓度和核酸片段的大小。如果您有大量样品，可能无法将两倍样品体积的乙醇加入试管中。异丙醇沉淀对于较大核酸片段和较低样品浓度的沉淀也是优选的，因为核酸在异丙醇中的溶解度较低。最重要的是，异丙醇沉淀是更快的方法，因为您不需要在离心前孵育您的样品。
1.2 优缺点
乙醇和异丙醇沉淀根本不昂贵，因为乙醇、异丙醇和乙酸钠非常便宜，并且该过程提供了高纯度核酸的良好收率。然而，这是一个非常耗时的过程，并且由于需要手动执行，因此变化很大。因此，低再现性可能是一个问题。
1.3 所需设备
乙醇或异丙醇沉淀所需的只是离心机和层流罩，或真空离心机来干燥颗粒。
2. 凝胶电泳和离心柱纯化
由于凝胶电泳根据核酸长度分离核酸，因此您可以使用此方法将感兴趣的核酸与其他核酸类型和污染物分离。
2.1 它是如何工作的？
首先，您需要运行凝胶。有关如何进行琼脂糖凝胶电泳的更多详细信息，请参阅我们关于核酸定量和可视化的文章的第 1 节。
可视化凝胶后，使用锋利的手术刀切除感兴趣的核酸条带。 在此步骤中，请始终记住佩戴适当的 PPE（面罩和手套），尤其是在使用紫外线来显示您的乐队时。 然后，使用合适的离心柱纯化试剂盒从 TAE 或 TBE 缓冲琼脂糖凝胶中纯化核酸条带。 由于可用的各种套件彼此略有不同，因此您应仔细遵循制造商的说明。 通常，您需要称量核酸条带的重量，每 100 mg 凝胶切片添加指定量的缓冲液，然后加热混合物以溶解琼脂糖。然后将样品转移到离心柱并纯化核酸 酸使用结合、洗涤和洗脱步骤。 有关离心柱协议如何工作的更多详细信息，请参阅我们关于核酸提取的文章的第 2.2.2.1 节。
2.2 优缺点
这种核酸纯化方法的巨大优势在于琼脂糖不会使核酸变性，因此很容易从凝胶中回收它们而不会造成任何伤害。但是，它不适合高通量实验室，因为运行凝胶非常耗时，并且仅限于少量样品。
2.3 所需设备
与其他纯化方法相比，此工作流程需要许多不同的仪器。琼脂糖凝胶电泳需要凝胶电泳系统、外部电源和生物安全柜，因为您将使用危险的嵌入染料。离心柱纯化要求不高，因为您只需要一台离心机。
3. 离心柱纯化
离心柱不仅用于从裂解样品中提取核酸，还用于纯化它们，例如在 PCR 反应后去除可能抑制后续应用的盐、酶、引物、引物二聚体和核苷酸。
3.1 它是如何工作的？
如上所述，离心柱纯化方案包括结合、洗涤和洗脱步骤。将样品转移到离心柱中后，将它们离心以将核酸结合到柱内的膜上。这允许不需要的组件通过。使用洗涤缓冲液的几个额外的离心步骤去除残留的不需要的材料，使用洗脱缓冲液的最后离心步骤将核酸从膜中释放出来。
3.2 优缺点
如您所见，这种纯化方法既快速又简单。最重要的是，它可以适应您的样品数量，因为您也可以使用 96 孔硅胶膜板代替单离心柱。但是，膜可能会堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脱体积，因此您可能会得到相当低的核酸浓度。
3.3 所需设备
离心柱纯化所需的唯一设备是离心机，除非您使用 96 孔格式并更喜欢使用带泵的真空歧管，这也是可能的。
4. 磁珠纯化
就像离心柱一样，磁珠既可用于从裂解样品中提取核酸，也可用于纯化。例如，您可以使用磁珠从 PCR 产物中去除盐、酶、引物、引物二聚体和核苷酸，否则会抑制后续应用。
4.1 它是如何工作的？
使用磁珠的纯化工作流程与提取工作流程非常相似。您首先添加将核酸结合到样品上的磁珠。
然后将试管放在磁铁上，去除含有不需要的未结合物质的上清液。您重复此步骤几次，在其间更换洗涤缓冲液。最后，您添加洗脱缓冲液并将样品转移到不同的容器中。
与使用磁珠的提取方案相比，在纯化过程中只有特定长度的核酸片段与磁珠结合。这种尺寸排阻机制是通过为感兴趣的核酸片段创造完美的结合条件，通过改变缓冲液、盐和它们的浓度以及因此的亲水性/疏水性来实现的。
4.2 优缺点
磁珠纯化的一个巨大优势是可以根据您的预算选择所需的设备。
选项 1：获取磁性支架并手动执行工作流程。这是最便宜的选择，但也是最乏味和最容易出错的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因为这会导致样品损失。
选项 2：对于高通量应用，您还可以购买台式移液机器人，或 96 或 384 通道移液器。这些设备减少了手动液体处理步骤，提高了生产率和可重复性，也可用于其他应用。有关如何将此类设备用于磁珠纯化的更多信息，请访问我们关于使用 MACHEREY-NAGEL 的 NucleoSpin® 96 质粒试剂盒进行质粒 DNA 纯化、使用 Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 ASSIST PLUS 进行 PCR 纯化以及使用Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 VIAFLO 96。
选项 3：通过购买专用纯化系统自动化整个工作流程。
磁珠纯化的另一个方便之处在于，您可以使用比旋转柱纯化更低的洗脱体积，而且它更易于扩展，因为您可以将它与 384 孔板一起使用。
4.3 所需设备
如前所述，您可以将磁珠纯化设备与您的预算相匹配。如果预算有限，可以购买磁性支架，如果有更多资金，可以购买台式移液机器人或 96 或 384 通道移液器，或者使用专用的纯化系统。
5.Sephadex® 纯化
Sephadex 纯化可用于从较小的分子中纯化核酸，例如引物、核苷酸或染料。
5.1 它是如何工作的？
Sephadex 是一种凝胶过滤树脂，由环氧氯丙烷交联的葡聚糖制成。5 要制备树脂，您需要将 Sephadex 粉末添加到离心柱中，用水再水合，然后离心柱以去除多余的水。在第二次旋转色谱柱之前，将样品添加到树脂顶部。在离心过程中，较大的分子很容易通过树脂并洗脱，而较小的分子会被困在葡聚糖珠的孔隙中。微珠的尺寸排除能力取决于您选择的 Sephadex 类型。例如，Sephadex G-25 Medium5可用于纯化分子量>5000的核酸，G-50 Medium6适用于分子量>30000的分子。
为了加快这一工作流程，请选择预装 Sephadex 的离心柱，而不是自己创建它们，或者在 96 孔过滤板中工作。
5.2 优缺点
就像离心柱纯化一样，该方法可以根据您的通量需求进行调整，方法是在离心柱或 96 孔滤板中进行。不存在分子-基质结合步骤还可以防止对核酸造成不必要的损伤，7 使其成为一种相当温和的纯化方法。然而，这非常耗时，尤其是在您自己准备离心柱或过滤板时——Sephadex 必须再水合大约三个小时——而且不能自动化。
5.3 所需设备
Sephadex 纯化所需的唯一设备是离心机。
6. 酶促方法
如果您的后续应用，一些制造商会提供酶法来清理您的 PCR 产物——例如Sanger 测序、下一代测序或 SNP 分析——要求您的样品不含未掺入的引物和 dNTP。
6.1 它是如何工作的？
酶促方法仅包括两个步骤。首先，将酶混合物添加到样品中，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。在孵育过程中，混合物中的第一种酶，核酸外切酶 I，将消化多余的引物，第二种酶，碱性磷酸酶，将去磷酸化 PCR 期间未消耗的 dNTP。酶发挥作用后，您可以将样品加热到 80 °C 再加热 15 分钟以使酶失活。
6.2 优缺点
除了快速简便之外，此方法不会导致样品损失，并且可以轻松适应您的样品数量。它唯一的缺点是它只能用于从引物和 dNTPs 中清除 PCR 产物，而不能去除任何其他 cont
7. 结论
如您所见，每种样品类型、下游应用和预算都有一种核酸纯化方法。 我们希望本文能帮助您确定选择哪一个来满足您的特定需求。
如果您来这里不仅是为了了解核酸纯化的技巧，您可能还想了解收集样本、提取核酸、执行 PCR 反应和量化核酸所需的知识。 当我们正在装备一个新的内部实验室时，我们整理了这个由五部分组成的系列，现在看起来像这样：
