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荧光染料（Fluorescent dyes）
Release Time：2022-08-20荧光染料的定义：
荧光染料（也称为荧光团/活性染料）可以简单地描述为分子（本质上是非蛋白质），在显微镜下，通过吸收给定波长的光并以更长的波长重新发射光来实现其功能。 这种荧光产生不同的颜色，可以可视化和分析。
荧光染料通常用于各种生物分子（抗体、肽、各种蛋白质等）的荧光标记，用于监测药物向目标组织的输送、成像等过程。
荧光染料分类：
※ 有机荧光染料
※ 生物荧光基团
一、有机荧光染料
本质上，有机染料的特征在于源自在整个生色团上离域的光学跃迁或源自分子间电荷转移跃迁（从激发电子态的分子内电荷转移）的发射。
在这里，表现出源自在整个生色团上离域的光学跃迁的发射的染料被称为共振染料（介观染料），而后者被称为 CT 染料（电荷转移染料）。花青、罗丹明和荧光素是一些最常见的共振染料，其特点是窄的吸收和发射带（略微结构化），往往相互镜像，以及小的、对溶剂极性不敏感的斯托克斯位移。
另一方面，CT 染料包括香豆素和丹磺酰荧光团等染料，其特点是与共振染料相比，吸收和发射带结构无结构，分离良好，以及更大的斯托克斯位移。
同样，与共振染料相比，CT 染料具有更小的摩尔吸收系数和荧光量子产率。
※ 对于共振和 CT 荧光染料，在结构-性质关系众所周知的情况下，可以通过精心设计的策略来微调光谱性质。
1.有机荧光染料的种类:
a. 荧光素
与花青和罗丹明染料一样，荧光素也是一种有机染料。 荧光素 的最大吸收波长为 494nm，最大发射波长为 521nm（通常吸收蓝色范围内的光并发射绿色范围内的光），荧光素是一种高荧光物质。 即使在非常少量的情况下也可以检测到它，并且在与抗体结合时用于显微镜检查。
荧光素的衍生物包括异硫氰酸荧光素、俄勒冈绿和羧基萘并荧光素等。 与许多其他荧光染料一样，荧光素价格低廉且易于使用，使其成为生物学研究中最受欢迎的染料之一。
与大多数其他染料不同，荧光素在水溶液中是无毒的。 因此，它是极少数用作地下水示踪剂的染料之一。
b. 异硫氰酸荧光素 (FITC)
异硫氰酸荧光素是流式细胞术和免疫荧光中最常用的有机荧光染料/探针之一。 它的特点是最大/峰值吸光度为 495nm，发射波长为 520nm，荧光素与荧光素之间的相互作用导致能量转移和浓缩时的自猝灭。
异硫氰酸荧光素染料标记分子应用：
(a)电泳分离后的蛋白质检测
(b)蛋白质和肽的微测序分析
(c)使用毛细管区带电泳进行分子分析
(d)生物相互作用中的分子跟踪和检测
(e)细胞和组织切片中的抗原检测
(f)通过标记 DNA 片段进行细胞凋亡检测
除了因其在水中的溶解性而易于用于偶联物制备外，异硫氰酸荧光素还具有明亮的荧光（由于偶联后的大消光系数和高量子产率），使其成为许多工艺的首选染料。
※ 在流式细胞术和免疫荧光显微术中，染料与各种抗体（一抗或二抗）结合，以检查和研究IL-17免疫缺陷和CD63在肾功能中的作用等状态。
※ 作为荧光素的衍生物，异硫氰酸荧光素含有一个异硫氰酸酯反应基团，这有助于其对通常存在于生物分子中的动漫和巯基基团具有反应性。
※ 流式细胞术简介
免疫荧光显微术涉及在显微镜下观察化学标记的分子，而流式细胞术涉及在流式细胞仪中检测和测量此类分子的特征。
在流式细胞术方法中，来自给定培养物/组织样品的细胞悬液（单细胞悬液）在微量滴定器中与荧光团标记的抗体一起孵育，然后在流式细胞仪中进行分析。
在流式细胞仪中，使用鞘液聚焦悬浮液，使其细胞一次一个地通过激光束。 然后检测发射的光（来自标记细胞的荧光）用于分析。
c. 花青荧光染料
花青类荧光染料属于共振染料，其特征在于具有离域电荷的氮原子（两个氮原子）之间的聚甲炔染料。 由于与生物分子的低非特异性结合以及明亮的荧光，花青类荧光染料已成为一些最流行的用于标记核酸的荧光染料。
花青类染料分为两大类：
※ 非磺化花青类染料 - 该组中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。 在大多数情况下，这些染料的特点是水溶性低，但胺的盐酸盐和酰肼除外。
它们首先溶解在有机溶剂（共溶剂）中，然后在生物分子标记期间添加到含有生物分子的溶液中。
而“Cy”代表花青，第一个数字代表存在于亚油啉基团之间的碳原子数。 另一方面，添加 0.5 后缀以表示苯并稠合花青。 这些荧光染料通常用于有机介质。
※ 磺化类花青染料 - 该组由磺基-Cy3、磺基-Cy5 和磺基-Cy7 组成。 顾名思义，这些花青的特征是一个磺基，它有助于染料分子在水相中的溶解。
与非磺化花青相比，这些花青更易溶于水，因此不需要溶解在有机溶剂中进行标记。 磺化花青通常用于标记疏水性蛋白质、水溶液中的纳米颗粒以及可能被 DMSO 或 DMF 变性的敏感蛋白质。
※ 两组染料均可用于标记以下生物分子：
肽、寡核苷酸和 DNA、抗体、可溶性蛋白质。
d.罗丹明荧光染料
与 曙红(Eosin) 和 荧光素一起，罗丹明属于呫吨族。 与市场上的许多其他染料相比，罗丹明具有出色的光稳定性以及许多光物理特性，使其非常适合用作激光染料、荧光探针和颜料。
它们在聚合物纳米粒子表面的表征、聚合物-生物偶联物的检测、活细胞的成像以及寡核苷酸在胶乳上的吸附分析等方面特别有用。
罗丹明荧光染料的衍生物也用作：
分子开关，病毒表面修饰，化学传感器，硫醇。
不同类型的染料通过它们各自的取代基（R1、R2、R3、R4 和 G）来区分。 由于它们的差异，这些荧光染料在溶液中也表现出不同的光物理特性（例如不同的荧光寿命和发射最大值）。
氨基被刚性化的罗丹明染料无论温度范围如何都表现出高量子产率，而在每个氮处具有两个烷基取代基的那些表现出活化的内部转化，量子产率和荧光寿命随温度的变化而变化。
※ 罗丹明 101 和罗丹明 B 是一些最常用的罗丹明染料，具有以下特点：
--羧基倾向于在酸性溶液中质子化
--染料转化为两性离子碱性溶液
--两性离子染料在极性较小的有机溶剂中变为无色内酯
* 要将罗丹明用作荧光探针，必须对其进行修改。 这可以通过(the xanthene moiety)氨基、羧基苯基环或羧酸基团的修饰来实现。
* 与 TRITC 一样，罗丹明 (NHS-rhodamine) 的 荧光特性为 544nm（最大吸收波长）和 576nm（最大发射）。
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二、生物荧光基团
在 1990 年代首次使用的绿色荧光蛋白（从水母维多利亚水母克隆）及其衍生物（例如藻红蓝蛋白、藻胆蛋白和藻红蛋白等）是当今生物学研究中最常用的一些生物荧光团。
虽然荧光团可用于在细胞、细菌和各种器官中表达质粒，但它们的使用有一些缺点，即它可能很耗时，并且在融合时还能够改变某些细胞蛋白的正常生物学功能。
此外，与许多其他荧光团相比，生物荧光团的光稳定性和灵敏度较低。
1. 绿色荧光蛋白 (GFP)
绿色荧光蛋白是最流行的生物荧光团之一，由 238 个氨基酸组成，其中三个负责发出可见绿色荧光的结构。 在水母本身中，荧光团与水母发光蛋白（一种蛋白质）相互作用，当添加钙时会发出蓝光。
通过 DNA 重组，研究人员可以使用负责产生蛋白质的基因来研究给定的基因和蛋白质。 在这里，在将复合物插入细胞之前，该基因与另一个基因（负责产生所需蛋白质的第二个基因）结合。
如果细胞产生绿色荧光，研究人员就可以明显看出该细胞能够表达目标基因。
* GFP 由 488nm 激光线激发，可在 510nm 处检测。
* 来自荧光团的微弱信号可以使用抗 GFP 抗体放大。
作为生物标记物，绿色荧光蛋白用于以下功能：
* 监测各种生理过程
* 识别蛋白质定位
* 检测转基因表达
2. 生物荧光团包括：
※ 藻红蛋白 - 藻红蛋白 (PE) 是一种红色蛋白色素复合物，属于藻胆蛋白家族。 它可以在红藻和隐植物中找到，它作为叶绿素色素的附属物。
在生物科学中，荧光团可以与蛋白质结合，例如用于抗原检测的抗体等，因为它能够发出明亮的荧光。 由于荧光团往往会很快发生光漂白，因此很少在荧光显微镜中使用。 它经常用于流式细胞术。
※ 别藻蓝蛋白 (APC) - 与藻红蛋白一样，别藻蓝蛋白也属于藻胆蛋白家族，是从红藻中分离出来的。 在 594 和 633 nm 的激光线激发下，荧光团的最大吸光度在 650 nm 处，而荧光发射峰在 66 nm 处。
与荧光素偶联物相比，荧光团的灵敏度已显示高 5 至 10 倍，并具有许多其他有益特性，包括大斯托克斯位移、高水溶性、长波长发射和耐猝灭。
虽然别藻蓝蛋白通常不用于需要光稳定性的应用，但它广泛用于流式细胞术、ELISA、微阵列等过程以及各种依赖高灵敏度的应用。
3. 量子点
量子点开发于 1980 年代，是尺寸范围在 2 到 50nm 之间的纳米晶体（无机纳米晶体）。根据大小，发出的光会从蓝色变为红色（小的 QT 呈现蓝光，而较大的 QT 呈现红光）。
与当今使用的其他一些荧光团相比，量子点具有很大的优势，因为可以通过控制粒径、表面化学、分布以及组成材料来控制/调节它们的光学特性。
因此，它们适用于免疫标记、多重生物检测以及体外和体内分析的分子成像等过程。
探针的主要特征之一是由于量子尺度效应，它们具有宽的激发波长范围以及窄的发射范围。
通过利用这一特殊特性，可以在同一光源下激发多色量子点，实现对生物样本中多个目标的多路检测和观察。
a.量子点与其他荧光团不同的一些有益特性包括：
* 表现出 40% 至 90% 的高量子产率
* 非常高的荧光强度 - 这比罗丹明 6G11 分子亮约 20 倍
* 高度抗光漂白
* 探头尺寸越大，发射波长越长
注意：量子点的主要缺点之一是发光间歇性（闪烁），这可能会影响分子检测的某些过程。
为了将生物分子连接到量子点（生物共轭），使用了以下策略：
* 电子相互作用——使用表面活性剂（如巯基乙酸）来修饰量子点表面并提高溶解度。
* 共价连接 - 涉及使用诸如将分子的官能团（例如羧基和氨基官能团）连接到量子点表面的策略。
* 作为介质的功能化微珠——可能涉及将量子点封装到聚合物微珠中，这使得它们表面的官能团能够与生物分子结合。
* 碳基量子点（例如石墨烯量子点）是新一代探针。 除了保留传统量子点的许多优点外，它们还被证明在生物共轭过程中表现出更有益的特性，而且细胞毒性很小。
4. 纳米粒子
纳米颗粒是指尺寸在 1 到 100 纳米之间的颗粒。由于它们的小尺寸，纳米粒子通常用于不同类型的细胞和组织的荧光成像。
当今生物成像中常用的一些纳米材料包括碳点、贵金属纳米颗粒、聚合物点、量子点和荧光掺杂二氧化硅等。
在成像中，与其他分子荧光团和探针相比，纳米颗粒/纳米材料具有多种优势，使其成为理想的选择。除了提高亮度外，纳米粒子是惰性的并且往往分布均匀，这有助于在成像过程中获得更好的结果。
此外，与各种分子荧光团相比，纳米颗粒和纳米材料没有细胞毒性，并且不受非特异性结合问题的影响。由于这些特性，大多数荧光纳米颗粒（染色纳米颗粒）可以内化到细胞/组织中，并容易靶向给定部位。
