Fluo-4, AM

---

Fluo-4 AM 钙荧光探针 介绍：
Fluo-4 AM 是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。Fluo-4 AM将Fluo-3 AM结构中的氯原子替换成了氟原子，导致它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长488 nm，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度会比Fluo-3强一倍。由于Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3相近，所以使用上和Fluo-3基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。
Fluo-4 AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，能够穿透细胞膜进入细胞中。Fluo-4 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494 nm，最大发射波长为516 nm。
Fluo-4 AM(钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存母液，浓度为2mM。
用于细胞内钙离子检测时，Fluo-4 AM的常用浓度为0.5-5 μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-4 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育10-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内充分转变成Fluo-4。

---

Fluo-4 AM实验步骤：
1、所需试剂：
※ 2 mM的 Fluo-4, AM（DMSO）试剂溶液，将1mg的Fluo-4, AM溶进442µL的DMSO中；
※ Pluronic F127； Hanks balanced salt solution（HBSS）
※ HEPES buffer saline（10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4）
2、实验步骤：
※ 向Fluo-4, AM/DMSO溶液中加入16.5mg的Pluronic F127，Pluronic F127可以防止 Fluo-4, AM在HBSS缓冲液中聚合，同时可以帮助其进入细胞；
※ 用 HBSS缓冲液 稀释 Fluo-4, AM溶液，制备出 4µM的Fluo-4, AM溶液；
※ 将制备好的Fluo-4, AM溶液加入细胞中，在37℃条件下培养约20分钟；
※ 加5倍体积且含有 1%胎牛血清 的HBSS缓冲液后，继续培养月40分钟；
※ 用 HEPES buffer saline进行洗涤细胞3次后，再用 HEPES buffer saline使细胞重悬浮，制备成 1×105 cells/mL溶液。
※ 37℃条件下培养约10分钟，再该细胞进行荧光钙离子的检测。荧光波长：激发波长494nm，发射波长516nm。

---

荧光图谱

---

钙荧光探针 Fluo-4 AM 实验注意事项：
1. Fluo-4 AM遇水极易分解，建议第一次使用时，母液分装并密封保存，同时注意保持干燥。
2. Fluo-4 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3. 探针的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等需要根据不同实验预先摸索。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
5.实验前需戴好防护眼镜，穿戴防护服和口罩，佩戴手套，避免与皮肤接触。
6.实验过程中如遇到有毒或者刺激性物质及有害物质产生，必要时实验操作需要手套箱内完成以免对实验人员造成伤害
7.实验后产生的废弃物需分类存储，并交于专业生物废气物处理公司处理，以免造成环境污染Experimental considerations:

---

1. Wear protective glasses, protective clothing and masks, gloves, and avoid contact with the skin during the experiment.
2. The waste generated after the experiment needs to be stored separately, and handed over to a professional biological waste gas treatment company to avoid environmental pollution.

---