BMPO

检测芬顿 (Fenton) 反应所产生的羟自由基：

1. 将1.5 mg的BMPO溶解于5 ml的超纯水。
2. 取15 μl的BMPO溶液，75 μl的1 mM的H₂O₂和75 μl的100 μM的FeSO₄加入到50 μl的超纯水中。
3. 放置一段时间 (例如1 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。
4. 通过峰值计算相对强度。

检测黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系 (XO) 所产生的超氧自由基：

1. 溶液A：将1 mg的BMPO溶解于1 ml的浓度为50 mM的PBS溶液 (pH 7.4)。
2. 溶液B：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有1 mMDTPA和0.4 mM黄嘌呤的混合溶液。
3. 溶液C：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有0.1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。
4. 取15 μl溶液A，135 μl溶液B和10 μl溶液C混合。
5. 放置一段时间 (例如 8 min) 将溶液转入EPR样品管中检测。
6. 通过峰值计算相对强度。

实验案例

(*本数据仅供参考)

*本数据EPR仪器检测得出，由于BMPO的分子结构在平面上下差异较大，使得图中BMPO/•OH的两种异构体的超精细结构常数较大能够被ESR分辨出来。本实验中BMPO/•OH的两种立体异构体与BMPO/•OOH的构成相似，两种BMPO结合物的适宜条件为：

构象异构体 (conformer)Ⅰ：

a_N =13.47 G，aH
a_H^β=15.31 G，aH
a_H^γ1 = 0.62 G
构象异构体 (conformer)Ⅱ：
a_N =13.56 G，aH
a_H^β=12.3 G，aH
a_H^γ1 = 0.66 G

超氧化物检测操作流程

1. 用100 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 制备浓度为25 μM的DTPA，作为过渡金属螯合剂。
2. 用100 mM PBS (pH 7.4)配制1 mM次黄嘌呤溶液。
3. 配制1 U/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。
4. 将10 mg的BMPO溶于200 μl的PBS溶液中。(终浓度约为 250 mM)。
5. 向EP管中加入70 μl缓冲液。
6. 继续添加20 μl浓度为250 mM的BMPO和100 μl步骤2中准备的1 mM的次黄嘌呤溶液。
7. 加入10 μl黄嘌呤氧化酶触发反应，将EP管漩涡震荡后转移到扁平池。
8. 上样并调整参数，获得图谱。

溶液终浓度为：25 mM BMPO， 0.5 mM次黄嘌呤和0.05 U/ml的黄嘌呤氧化酶。

羟自由基操作流程
1. 分别准备1 mM的FeSO4，10 mM的H₂O₂和250 mM的BMPO水溶液。
2. 向EP管中加入140 μl的超纯水。
3. 继续加入20 μl浓度为250 mM的BMPO和20 μl浓度为1 mM的FeSO₄。
4. 加入20 μl浓度为10 mM的H₂O₂，触发反应。
5. 混合并迅速转移至扁平池中。
6. 上样并调整参数，获得图谱。
溶液终浓度为：25 mM BMPO，0.1 mM FeSO₄和1 mM H₂O₂
*建议实验人员做背景图片，以在EPR图谱中排除自选杂质的干扰。

相关参考数据

超氧化物信号强弱随时间的变化曲线和半衰期时间

*BMPO检测超氧阴离子O^2•-的半衰期 (pH=7.4) 更长。因此更适合长时间观察样品的实验。(如检测生物酶反应)