FerroOrange

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FerroOrange Fe2+检测探针：
铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。 近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注， 游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子 (Fe²⁺) 和铁离子 (Fe³⁺)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe²⁺的水溶性时，了解Fe²⁺的行为比了解Fe³⁺的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe²⁺进行荧光成像。

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溶液制备
在含有24 μg FerroOrange的管中加入35μl DMSO，用移液器吹打混匀，配制得到1 mmol/l FerroOrange溶液。 用HBSS溶液稀释1 mmol/l 的FerroOrange溶液，制备得到1 μmol/l 的FerroOrange工作液。
* DMF或乙醇也可以代替DMSO进行制备。 该溶液在-20℃稳定1个月。 1 μmol/l FerroOrange工作液不稳定。需要现配现用，并尽快使用。
* 必要时，可使用无血清培养基代替HBSS，血清会增加背景。

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操作步骤

1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱中孵育过夜。
2.弃去上清液，并用 HBSS 或 无血清培养基 洗涤细胞3次。
3.更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。
※ 根据药物特性优化孵育时间。
4.加入浓度为1 μmol/l的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO2培养箱中孵育。
※ 加入FerroOrange染色剂后请立即观察，不要洗涤。
5.在荧光显微镜下观察细胞。

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FerroOrange 产品特点：
※ 高灵敏度
※ 可以与其他染料共染
FerroOrange 产品规格：
※ 性状：可溶于乙腈，甲醇和二甲基亚砜。
※ 纯度（HPLC）：92.0%以上
※ 荧光光谱：符合一致性

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FerroOrange 实验案例：
HeLa cells treated with chelator of iron 2,2′-bipyridyl (Bpy) (100 μmol/L) or Ammonium iron (II) sulfate (100 μmol/L) were prepared. The change of intracellular Fe2+in HeLa cells was detected by the FerroOrange.
※ 荧光显微镜

Ex/Em = 561 nm/570-620 nm, Scale bars 20 μm
Left Control
Middle Ammonium iron (II) sulfate and 2,2′-Bipyridyl (Bpy) treated
Right Ammonium iron (II) sulfate treated
The fluorescence intensity of FerroOrange was increased in HeLa cells treated with Ammonium iron (II) sulfate compared with the findings in untreated cells; conversely, its fluorescence intensity was decreased in cells treated with Bpy.

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※ Plate Reader Assay

Ex/Em = 543 nm/ 580 nm
Left Control
Middle Ammonium iron (II) sulfate and 2,2′-Bipyridyl (Bpy) treated
Right Ammonium iron (II) sulfate treated
The change of intracellular Fe²⁺in HeLa cells was quantified by the FerroOrange.

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金属离子选择性

Ex/Em = 543 nm/ 580 nm
2 μL of 1 mmol/L FerroOrange and 2 μL of 10 mmol/L from each metal were added to 1 mL of 50 mmol/L HEPES Buffer (pH7.4). The fluorescence intensity was measured after the reaction, for 1hr, at room temperature.

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FerroOrange 应用
1. 监测亚细胞不稳定Fe2+的高通量方法
FerroOrange 可用于活细胞中不稳定的 Fe(II) 的基于 96 孔板的高含量成像。 在接下来的文章中，Hirayama 博士等人能够对包含 3399 种化合物的化学文库进行高通量筛选。
使用极其灵敏的荧光探针进行高通量筛选以发现铁稳态调节剂
*FerroOrange 在参考文献中被称为“RhoNox-4”。
*FerroOrange 在 Hideko Nagasawa 博士和 Tasuku Hirayama 博士（岐阜药科大学）的指导下商业化。
2. 铁死亡研究中小鼠肝脏中亚铁离子（Fe2+）的检测
在以下文章中，使用 FerroOrange（Ferroptosis 研究）在小鼠肝脏中检测到亚铁离子 (Fe2+)。
* 以缺乏蛋氨酸胆碱的饮食喂养小鼠
Targeting Ferroptosis Alleviates Methionine-Choline Deficient (MCD)-diet Induced NASH by Suppressing Liver Lipotoxicity

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FerroOrange与各种细胞内的染色试剂共染
用各种染色试剂染色HeLa细胞，清洗细胞。然后将FerroOrange添加到细胞中，并用荧光显微镜观察。
与ER染色试剂共染 
※ 检测条件
FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm
ER Tracker Green（ER染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm
标尺: 10 μm

 

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与线粒体染色试剂共染
※ 检测条件
FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm
MitoBright Deep Red（线粒体染色试剂）: Ex: 640 nm、Em: 650-700 nm
标尺: 10 μm

 

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与高尔基体染色试剂的共染
※ 检测条件
FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm
BODIPY FL（高尔基体染色试剂）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm
标尺: 10 μm

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Excitation and Emission Spectra

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FerroOrange 常见问题
1. FerroOrange只会检测游离铁吗？还是某些如铁硫蛋白里的结合铁，都可以检测吗？
FerroOrange只检测游离的二价铁
2. 染色时需要注意什么？
※ FerroOrange染色后的对培养基的更换。
染色后无需清洗工作液，通常血清中含有铁离子，请注意使用不含血清的培养基，所以染色后即使细胞外有残留的FerroOrange，但是因为细胞外没有血清中铁离子的影响，也不会产生背景荧光的问题。
※ 细胞难以染色(灵敏度低)时的办法。
根据细胞种类的不同，染色程度也有差异。
使FerroOrange working solution浓度高于推荐的1 µmol/l进行染色。建议在1-5 µmol/l范围内染色。

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3. 使用荧光酶标仪的操作步骤
样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。
样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。
样品C：添加铁(硫酸铵铁)的HeLa细胞。
<测量操作>。
1.在96孔黑板(透明底)上接种100 µl HeLa细胞悬液，使其达到10,000 cells/well，在37℃  5%CO2 培养箱中过夜培养。
2.样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 µl洗涤3次。
3.向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 µmol/l)，在37℃  5%CO2培养箱中静置30分钟。
4.用100 µl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。
5.向样品A和C中添加100 μl的1 µmol/l FerroOrange working solution ，向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 µmol/l)和Bpy(最终浓度:100 µmol/l)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO2培养箱中培养30分钟。
6.用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

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