MitoTracker Deep Red FM

配制 MitoTracker Deep Red FM 储存液:

※ 是以粉末形式提供，使用前需产品回温至室温。

※ 之后使用细胞培养级别的无水DMSO 将其充分溶解至终浓度1 mM。

※ 分子量：M. Wt.= 543.58 g/mol，换算下来，50 µg粉末只需加入92 µL DMSO即可得到1 mM储存液。

※ 可根据单次的使用量将储存液分装后放到-20℃避光，避免反复冻融。

2. 配置工作液

※ 根据不同的实验目的使用不同的探针浓度，以下的起始操作条件仅作参考，可根据细胞类型和其他的相关因素如细胞或组织的透化等进行适当调整。

※ 用适当的缓冲液或者细胞培养基稀释1 mM储存液至工作液浓度。一般推荐使用浓度为25-500 nM。对于后续需要做固定或透化的样本，推荐工作浓度为100-500 nM，为了降低过度加载导致的潜在伪影和线粒体毒性，在不影响实验结。
※ 果的前提下应尽可能低浓度染色。另外，浓度过高也可能对其他细胞结构进行染色。

3. 染色及检测

1）贴壁细胞的染色

培养皿/板内加入适量的培养基覆盖盖玻片进行爬片培养。当细胞长至所需丰度，吸除培养液，加入37℃预热的MitoTracker® Deep Red FM染色工作液。在所使用细胞正常培养条件下孵育15-45 min（最佳孵育时间需优化）。染色结束后，使用新鲜培养液或缓冲液替换上述染色液，即可将其置于荧光显微镜下观察或荧光酶标仪下读数。或者进行后续的固定和透化步骤，见步骤4。

2）悬浮细胞的染色

离心收集细胞，吸除上清，利用37℃预热的MitoTracker® Deep Red FM染色工作液轻轻重悬细胞。在所使用细胞正常培养条件下孵育15-45 min（最佳孵育时间需优化）。染色结束后，离心收集细胞，利用37℃预热的新鲜培养液或缓冲液重悬细胞，被染色的细胞可用流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜进行分析。

如果需要盖玻片上固定化的细胞，那么可在铺片前先用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被载玻片或盖玻片。

或者进行后续的固定和透化步骤，见步骤4。

4. 固定和透化

1）染色结束后，利用培养液或缓冲液清洗细胞；

2）小心吸走清洗液。换用新鲜配制且预热的含2-4%甲醛的缓冲液或培养液进行细胞固定。

3）清洗细胞：吸除固定液，用适当缓冲液冲洗细胞数次。

4）细胞透化（可选）：

像ICC等实验需要细胞要做透化，则可将已固定的细胞直接加入含有去污剂如Triton X-100的缓冲液中孵育。透化结束后，用缓冲液清洗细胞即可进行后续ICC实验。经检测，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育内皮细胞10 min可以达到良好的透化效果。

另外，还可利用预冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗细胞。经验证，即使后继没有进一步的抗体标记，丙酮透化处理也可降低背景信号。