NBD C6-Ceramide

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NBD C6-Ceramide(86701-10-2,NBD C6-神经酰胺)说明：
NBD C6-Ceramide （also as C-6 NBD ceramide） is a fluorescent sphingolipid analogue that is permeable to cell membranes and is a vital stain for the Golgi apparatus, endoplasmic reticulum, and nuclear envelope of mammalian cells. In the presence of 10 microM monensin (sc-200109) the visibility of the fluorescence is diminished on the plasma membrane, whereas the appearance of the Golgi apparatus is amplified. C-6 NBD ceramide has been known to produce the two fluorescent metabolites sphingomyelin and glucocerebroside intracellularly in the Golgi apparatus, which are then transported to the cell surface. In addition, monensin inhibits the ability to remove the fluorescent metabolites sphingomyelin and glucocerebroside from the cell surface by back exchange.

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实验步骤：
一、制备 NBD C6-Ceramide-BSA 复合物
对于活细胞或固定细胞的染色，使用添加 BSA 的 NBD C6-Ceramide-BSA 复合物能够得到较好的染色效果。NBD C6-Ceramide-BSA 复合物制备方法如下：
1. 以氯仿：乙醇（体积比 19:1）为溶剂配制 1 mM NBD C6-Ceramide 溶液；
2. 吸取 50 µl NBD C6-Ceramide 溶液于小玻璃试管中，保持干燥，通入氮气流，然后在真空状态保持至少 1 小时，以 200 µl 无水乙醇重溶。
3. 量取 10 ml 无血清的平衡盐溶液（如 HBSS 或 HEPES，pH 7.4）到 50 ml 塑料离心管中，加入 3.4 mg（使其浓度为 0.34 mg/ml）的脱脂 BSA。
4. 将含有 10 ml BSA 溶液的试管置于漩涡混合器上混匀，加入 200 µl NBD C6-Ceramide 溶液，漩涡震荡混匀，所得溶液（5 µM NBD C6-Ceramide+5 µMBSA）保存于-20°C。
二、活细胞高尔基复合体染色
1. 用合适的缓冲液（如 HBSS/HEPES）冲洗盖玻片上的细胞；
2. 加入 5 µM NBD C6-Ceramide+5 µM BSA 溶液于 4°C 孵育细胞 30 分钟；
3. 用预冷的新鲜培养基反复冲洗细胞数次，37°C 孵育细胞 30 分钟；
4. 用新鲜培养基冲洗细胞，荧光显微镜镜检。
三、经过固定处理的细胞高尔基复合体染色
注意：染色条件同活细胞样品，但应避免使用含甲醇/丙酮类的固定剂。
1. 用 HBSS/HEPES 缓冲液冲洗盖玻片上的细胞，用 0.5%戊二醛/10%蔗糖/100 mM的 PIPES 缓冲液（pH 7.0）或者 2~4%多聚甲醛（溶于 PBS）溶液室温下固定5~10 分钟；
2. 用预冷的 HBSS/HEPES 反复冲洗细胞数次，加入 5 µM NBD C6-Ceramide+5 µMBSA 溶液于 4°C 冰浴孵育 30 分钟；
3. 用 HBSS/HEPES 冲洗细胞样品，以 10%的 FBS 或者 2 mg/ml 的 BSA 在室温下孵育 30~90 分钟，以加强高尔基体染色效果；
4. 用新鲜的 HBSS/HEPES 将细胞样品冲洗干净，荧光显微镜镜检。

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光谱图：

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NBD C6-神经酰胺实验注意事项：
1.实验前需戴好防护眼镜，穿戴防护服和口罩，佩戴手套，避免与皮肤接触。
2.实验过程中如遇到有毒或者刺激性物质及有害物质产生，必要时实验操作需要手套箱内完成以免对实验人员造成伤害
3.实验后产生的废弃物需分类存储，并交于专业生物废气物处理公司处理，以免造成环境污染Experimental considerations:
1. Wear protective glasses, protective clothing and masks, gloves, and avoid contact with the skin during the experiment.
2. The waste generated after the experiment needs to be stored separately, and handed over to a professional biological waste gas treatment company to avoid environmental pollution.

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