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单细胞凝胶电泳实验(凝胶电泳,简单介绍,实验步骤,注意事项)
Release Time：2020-08-18一，单细胞凝胶电泳实验简单介绍
单细胞凝胶电泳实验（又称彗星实验）的操作过程主要包括单细胞悬液制备、凝胶板制备、细胞裂解与解卷、电泳与中和、染色与观察等步骤。下面是单细胞凝胶电泳的操作步骤和注意事项。二，单细胞凝胶电泳实验步骤
2.1分离并制备单细胞悬浮液：1.体外培养的细胞系：用胰蛋白酶消化，最后用PBS悬液和移液管形成单细胞悬浮液。细胞需要计数。我已经提到了具体数额。
2.体内器官细胞：处死动物，取出器官，在汉克斯溶液中制备单细胞悬液。
2.2橡胶板制备：
1.取100μl 0.5%NMA，置于45℃水浴中，涂于磨砂玻璃载玻片上，形成底漆。均匀地推动盖子滑动，无气泡，并在4度下固化5至8分钟。
2.水平移开盖玻片，取100μl 0.5%LMA于37℃水浴中孵育，20μl细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺开载玻片，加盖玻片，4℃固化5～8分钟。
2.3细胞裂解和电泳：
1.从制备好的橡胶板上取下盖玻璃后，将其浸入4℃预冷的细胞裂解液中，在4℃下裂解2.5～3小时。
2.取出凝胶板，用双蒸馏水浸泡冲洗，放入电泳槽，在4℃预冷的电泳液中浸泡20分钟。
3.将玻片水平放置在阳极端附近，在4°C下进行20至25分钟（25 V，300 mA）的电泳。可以在电泳槽周围加冰块保持低温。
2.4中和染色：
1.电泳结束后，将凝胶板在中和液中浸泡10分钟，每次共3次，每次更换中和液。最后晾干。
2.取出橡胶板，放入染色罐中，用2μg/ml EB染色液在黑暗中染色5～10分钟。
3.用蒸馏水冲洗两次，每次5分钟。让其干燥，滤纸吸收多余的水分，并尽快在荧光显微镜下观察。
三，单细胞凝胶电泳实验注意事项
1.细胞必须被消化成单个细胞。如果你生长的细胞是悬浮生长的，或者形状是圆形的（如hela），那么你可以直接刮取细胞，否则，如果细胞是非圆形的，如成纤维细胞等，在实验前必须用胰蛋白酶消化使其变圆。许多彗星实验总是不能产生结果。你可以考虑这是否是原因。
2.在电泳过程中，每次实验的电流和电压强度都应该是恒定的（例如：20伏，200毫安恒定），这样慧尾才有分析价值，否则你就不知道分析因子的差异是由于电泳条件的不同而引起的，这些变化是由不同的细胞处理引起的。
3.关于掉胶问题：最好在玻璃盖的两面涂上一层剥落的硅烷（一大瓶便宜，但有毒），这样会更好
4.裂解物是整个实验中最关键的因素。当最终使用时，裂解液必须是干净的，没有任何沉淀物。如果溶解不好，肯定会影响实验。如果在室温下不易溶解，可在4℃冰箱中放置一段时间，更容易溶解。
三，单细胞凝胶电泳实验试剂清单
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 胰蛋白酶 | SS2235 | 9002-07-7 | |
| 2 | PBS缓冲液 | SS6235 | ||
| 3 | 溴化乙锭(EB) | SS1957 | 1239-45-8 | |
| 4 | 硅烷 | HCC344681 | 7803-62-5 |
