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植物病原物分离，培养与移植（,实验简介,实验步骤,注意事项,实验所需试剂）
Release Time：2020-07-31一、植物病原物的分离，培养与移植实验简介：
植物病原物的分离，培养与移植实验要求了解植物病原体菌，细菌，病毒和线虫的分离，培养并且接种的一般方法，并掌握其基本原理；了解植物传染病研究中常用的接种方法，比较不同接种方法在疾病发展过程和外部环境上的差异。
二、植物病原物的分离，培养与移植实验步骤
（一）病原菌的分离和培养
植物病原微生物分离和培养工作应在专门的无菌手术室或超净工作台中进行，但也可以在干净安静的室内进行。工作时在桌面上铺一块湿纱布，然后将所有工作用具放在湿纱布上。尽量少在室内四处走动，以减少空气流通，减少污染。所选的分离材料应尽可能新鲜，以减少腐生细菌混合的机会。从患病组织的边缘靠近健康组织可以减少污染。同时，这部分病原生物处于相对活跃的状态，生长迅速，易于成功分离。
植物病原菌的分离有组织分离法和稀释分离法两种，在病组织上产生大量孢子的病原菌以及病原细菌的分离都可用稀释分离法。
1组织分离方法请遵循以下步骤：
（1）培养皿的准备：取一块无菌的培养皿，放在湿纱布上，在盖子上注明分离的日期，材料和分离者的名字。
（2）培养皿平板制备：用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1－2滴（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼胶中一管倒入培养皿中，轻轻摇动使成平面（分离细菌时则不能加乳酸）。
（3）切开小块患病组织（叶斑病）：取新鲜的病叶，选择典型的单个病斑，然后用剪刀或手术刀从病斑边缘切小块（每侧约3个） -5毫米长）。组织几个街区。
（4）表面消毒：将患病小块的组织浸入70％酒精中几秒钟后，按照无菌方法，将患病组织移入0.1％汞升的溶液中1-3分钟，然后将其置于无菌状态水连续冲洗三遍。您也可以使用漂白粉片（1-2片），研磨后添加10ml无菌水，并灭菌5-10分钟。用蘸有70％酒精的脱脂棉擦拭患处，水果，块茎和树枝等组织内部的病原菌，并用火焰将表面酒精燃烧掉，重复2-3次即可表面消毒。
（5）用无菌操作法将病组织小块移至中平面上，每培养皿内可放4－5块。
（6）将培养皿翻转至26-28℃恒温在一个盒子里耕种，并在3-4天后观察结果。
（7）用无菌方法从培养皿中选择菌落，挑一些菌丝和孢子，显微镜下观察。如系玉米小斑病菌孢子，即可用接种针自菌落边缘挑取小块菌落移入斜面中，在26－28℃恒温箱内培养，3－4天后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得玉米小斑病菌纯菌种，可置于冰箱中保存。如有杂菌生长，需再次分离获纯培养后，方可移入斜面保存。
2稀释分离方法
以棉花红色腐烂果实为材料，按照以下步骤分离：
（1）取三个无菌培养皿，将它们平放在湿纱布上，并编号（1、2、3），并注明日期，分离材料和分离人员的姓名。
（2）用无菌吸管吸取无菌水，然后在每个培养皿中倒入0.5-1.0 ml无菌水。
（3）用无菌接种诱饵从棉红腐烂的果实上刮下病原芽孢，将其放入培养皿中的水滴中，制备芽孢悬液。
（4）将诱饵孢子悬浮液浸入接种诱饵中，并与第一个培养皿中的灭菌水混合，然后将三个诱饵孢子悬浮液从第一个培养皿转移到第二个培养皿中，并再次混合。将三饵孢子悬浮液转移到第三培养皿中。每次转移之前，必须在酒精灯的火焰下燃烧诱饵。 ˇ
（5）将三管熔化并冷却到45℃左右的中，分别倒在三个培养皿中，摇动使中与稀释的菌液充分混匀，平置冷却凝固。
（6）翻转培养皿并将其置于恒温器中（26-28°C）进行培养，并在3-4天后观察菌落的生长。
（7）获得纯培养物后，从菌落边缘挑选菌丝块并将其移至倾斜表面以培养3-4天，然后将其保存在冰箱中。
为了获得纯培养物，通常需要将其稀释并分离3次（重复3次）。当培养物高度一致时，可以将其作为纯培养物进行保存。
3 菌的培养
植物病原菌多为好气性菌，在有丰富营养的中上能很好地生长，但它们对温度的要求差异较大，绝大多数的菌可以在20－30℃间正常生长，但少数要在15－20℃间才能正常生长，少数菌孢子必须在5℃左右的低温下才能萌发。
（二）病原菌的分离培养
分离病原菌的最常用方法是稀释分离和条纹分离。在分离之前，应首先通过细菌学诊断患病的材料，也就是说，只有在显微镜检查确认有喷雾剂后才可以分离患病的组织（少数情况下没有喷雾剂）。
1稀释分离方法
稀释分离法是最经典的标准分离法，方法与菌孢子稀释分离法基本相同，但要将病组织放在灭菌水中用灭菌玻棒研碎并让组织碎块在水中浸泡30－60分钟（在灭菌培养皿中研碎并浸泡），让细菌充分释放到灭菌水中成为细菌悬浮液再进行稀释分离。
2.划痕分离方法
除了上述稀释分离方法之外，更方便的方法是条纹分离方法。步骤如下：
（1）预先把NA中倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中4－6小时，使表面没有水滴凝结。
（2）准备细菌悬浮液。
（3）在培养皿盖上写下分离材料的名称，日期和名称。
用无菌接种诱饵将细菌悬浮液浸入干燥的中平板表面按图17所示方法划线。划过第一次线后的接种环应放在火焰上烧过，冷却后直接在第一次划线的末端向另一方向划线，同上，灭菌后再划第三、第四次线。
（4）翻转培养皿并将其放入26-28°C的培养箱中。 2-3天后，观察是否存在细菌生长以及单个菌落的生长位置（C）。
（5）仔细挑选单个菌落并将其移至试管的斜面。同时，使用无菌水将细菌的单个菌落稀释成悬浮液，以进行第二次条纹分离。如果通过两次划线分离获得的菌落的形态学特征与典型菌落特征一致且一致，则意味着已经获得了纯培养物，最好进行三个连续的单个菌落分离。确保纯化。
3细菌的培养
病原菌的培养条件因种类而略有不同。棒状杆菌的生长温度低（20-23°C）；假单胞菌中的青枯雷尔氏菌需要较高的温度（35℃）才能发育良好。欧文氏菌软腐病在厌氧条件下比在有氧条件下生长更快，并且更具致病性。
（三）植物病毒的分离与纯化
植物病毒的分离和纯化是特殊的。由于该病毒是专性寄生虫，因此无法离开活宿主。尽管在操作过程中不需要无菌操作，但必须进行严格的隔离以防止污染和混合。使用具有花叶病症状的患病烟叶作为材料进行病毒“单点分离”和纯化。步骤如下：
（1）首先，用肥皂水洗手，并特别注意清除指甲上的污染物。
（2）摘下一半患病叶子并将其放在无菌砂浆中，加入磷酸盐缓冲液（0.01M PBS，pH 7.2）1毫升（5-6滴），研磨。
（3）在心叶烟草秧苗和the菜秧苗健康秧苗的顶部平叶上撒一点金刚砂（600目/英寸2）进行接种，然后用手指蘸取患病汁液并轻轻涂抹叶（擦拭接种），写上标签卡并将其插入锅中。
（4）3分钟后，用自来水冲洗接种的叶子并将其放在温室中进行栽培。
（5）2-3天后，在接种的叶子上出现坏死的死斑，最初是绿褪色的，后来是黄白色的。
（6）切下一个死斑，然后按照上述方法接种健康的烟草和mar藜种子，使其重新出现形状，大小和颜色相同的死斑，这是已经分离和纯化。该材料可在快速干燥后低温保存。
（7）分别在黄瓜或普通烟草上接种斑点斑点的叶片，以获得系统的镶嵌症状。在不同的宿主植物上接种不同的病毒会导致不同的症状。选择这些特定的寄主植物作为诊断病毒和病毒性疾病的区分寄主可以进行初步鉴定。将病态的组织汁接种在死点宿主上。根据死点的特征，可以进一步区分病毒类型，并将其用作简单的病毒定量方法。
（四）分离植物病原线虫
大多数植物的寄生线虫只会破坏根部，有些会在根部内寄生，有些会破坏地面上的茎，叶，花和果实。从病态植物材料和土壤中分离线虫的方法很多。它们有自己的优点和缺点。常用的方法包括漏斗分离，浅盘分离和浮选。
1贝尔曼漏斗分离方法
该操作简单方便，适用于分离植物材料和土壤中相对活跃的线虫。通常，使用直径为10-15 cm的塑料漏斗，然后使用带有约5-10 crn弹簧夹的乳胶管。漏斗放在木框或铁环上，漏斗充满水，病态的植物材料或土壤。用双层纱布包裹样品，然后将其缓慢浸入清水中。浸泡24小时后，样品中的线虫由于水的作用从材料的中间游到水中，并由于自身的重量逐渐沉入漏斗底部的橡胶管中，并缓慢释放5ml。将离心管中的水倒入离心机中，以1500 rpm的速度离心3分钟，倒入上层水，将底部沉淀物与线虫一起倒入玻璃杯或计数皿中，并在解剖显微镜下计数。然后将线虫放入装满固定剂的小玻璃管中使用。样品材料也可以用网筛放在漏斗的嘴上，以便水表面可以浸没材料，而线虫也可以释放出来并沉淀到底部。
2浅盘分离方法是将两个不锈钢浅套管组合在一起，上面的一个称为筛盘，底部是筛子（10目/英寸2），下面的筛子稍大一些。容器。水盘（机箱）。
将特殊的线虫滤纸放入筛盘，用水浸湿，然后在其上放一层餐巾纸。将土壤样品或要分离的材料放在餐巾纸上。加水以将材料浸入两个托盘之间的间隙中。 ）保持8天，材料中的大多数线虫都会磨损过滤纸进入托盘中的水，收集托盘中的水样本通过两个小筛（上层是25目粗筛，下层是400目细筛）。线虫大多集中在下部筛上，可用少量水冲洗到计数皿中。
浅板法比漏斗法更好，它可以分离更多的活虫，并且碎屑和其他碎屑更少。
3囊状漂浮物分离方法（Fenwick-Oostenbrink改进的漂浮方法）
对于不活跃的线虫囊肿，可以使用Fenwick浮动管分离囊肿。试管中先装满水，然后将10.0g的风干土壤放入顶部筛子中。用强力水冲洗漂洗的土壤样品，然后将所有样品倒入量筒中，然后用细水从顶部筛子中加入，使土壤颗粒和其他杂物沉入量筒的底部，并产生囊肿和草渣逐渐沿着嘴的倾斜环漂浮。槽流入接收筛（100目），首先将筛中的囊肿沉入烧杯中，然后将其倒入装有滤纸的漏斗中以在滤纸上收集细胞质。在解剖镜或放大镜下，学习使用镊子，发针，竹针，刷子和其他工具从水样或滤纸中拾取线虫。
（五）拌种和浸泡方法
这两种接种方法可用于种子传播的疾病。拌种是将病原体的悬浮液或孢子粉混合在植物种子上，然后播种引起疾病。用这种方法可以接种小麦胚芽。浸种方法是用孢子或细菌悬浮液浸种，然后播种。用这种方法可以接种大麦黑穗病，棉花炭疽病和豆腐病。
（六）土壤接种方法
可以通过混合土壤来接种被粪肥和土壤感染的疾病。土壤接种方法是用细菌压碎人工培养的病原体或植物，在播种前或播种过程中将其施用于土壤，然后播种。也可以先打开沟渠，在沟渠底部撒一层患病体或细菌液，然后将种子播种到患病体上，然后覆盖土壤。有些病原体（土壤中的细菌）可以在土壤中长期生存。用真菌土壤或线虫接种剂将土壤样品接种到无菌（蠕虫）土壤中，然后种植植物以感染植物。如棉花枯萎病，小麦土传花叶病毒和一些线虫病。对于青枯雷尔氏菌，可以使用土壤灌溉的方法。
（七）喷雾法和喷撒法
这两种方法适用于气流和雨水传染的病害，大部分细菌病害和菌叶部病都可采用喷雾接种，如水稻细菌性条斑病、玉米大斑病、小斑病。将接种用的病菌配成一定浓度的悬浮液，用喷雾器喷洒在待接种的植物体上，在一定的温度下保湿24小时，诱发病害。
（八）伤口接种
除了植物病毒接种时常用的摩擦接种属伤口接种之外，植物病原细菌、病原菌也常用伤口接种法。许多由伤口侵入，导致果实、块根、块茎等腐烂的病害均可采用。先将接种用的瓜果等洗净，用70％酒精表面消毒，再用灭菌的接种针或灭菌的小刀刺伤或切伤接种植物，滴上病菌悬浮液或塞入菌丝块，用湿脱脂棉覆盖接种处保湿。
大米的细菌性枯萎病接种通常用于切叶接种和针灸接种。首先，用火焰或75％的酒精对解剖剪刀进行消毒，将剪刀浸入细菌枯萎病悬浮液中，使剪刀的刀口浸入细菌溶液中，然后切掉要接种的稻叶尖端。无需润湿接种部位并定期观察病情。细菌悬浮液的浓度为108 cfu / ml。
（九）矢量接种
菟丝子接种是温室中广泛用于研究病毒，支原体和其他疾病的接种方法。首先，菟丝子感染了患病的植物，在建立寄生关系或进一步扩展后，患病的植物感染了健康的植物，并且该疾病通过接种菟丝子传播到了健康的植物上。
三、植物病原物的分离，培养与移植实验注意事项：
所有接种实验都应有一个对照，即使用清水代替细菌，以相同的方法接种，并观察疾病是否发生。用土壤灌溉法接种青枯雷尔氏菌，用喷雾接种法接种稻瘟病菌，通过切叶接种法接种米氏黄单胞菌。接种不同疾病后要注意培养条件，观察不同疾病症状的出现。的过程。
实验时间共计4天。
四、植物病原物的分离，培养与移植实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 氢氧化钙 | JT8649 | 1305-62-0 | |
| 2 | 氯化钙 | LSH75217 | 22691-02-7 | |
| 3 | 次氯酸钙 | JH0613 | 7778-54-3 | |
| 4 | 乙醇 | CCF12679 | 127852-29-3 | |
| 5 | 汞 | JT0036 | 7439-97-6 | |
| 6 | 90mm*20mm 塑料培养皿(灭菌） | FM-90-G | ||
| 7 | 10*10cm方形塑料培养皿(灭菌） | FM-100-F | ||
| 8 | 无菌去离子水 | HC1314 | ||
| 9 | 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） | PYJH51022 |
