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Western(实验简介,实验所需材料及试剂,实验步骤,注意事项)
Release Time：2020-07-18一、Western实验简介：
Western是用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下，通过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固体支持物上，然后使用抗原-抗体特异性反应从蛋白质混合物中检测出来，靶蛋白，用于在正常或实验条件下定量或定性确定靶蛋白在细胞或组织中的表达，Western印迹法还可用于蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用的后续分析，作为廉价，方便，可靠的研究工具，它将与蛋白质组学和质谱技术等技术一起在蛋白质组学时代起重要作用。影响免疫印迹成功的主要因素是抗体识别的抗原分子中表位的性质，由于抗原样品的变性，只有那些识别耐受性表位的抗体才能与抗原结合，大多数多克隆抗体或多或少都包含此类抗体，因此多克隆抗体通常用于免疫印迹，第二个影响因素是蛋白质储液中抗原的浓度，在免疫印迹之前，需要通过免疫沉淀和亚细胞分离来富集一些低表达水平的蛋白质。
二、Western实验所需材料及试剂：
三、Western实验步骤
（一）、样品制备
对于Western Blotting实验，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白质样品必须是均质的，可溶的并解离为单个多肽亚基，并且必须使彼此之间的聚集最小化，从而使其最终取决于自身的分子量，当靶蛋白的含量非常低时，有必要选择靶蛋白含量高的组织或细胞器（例如核提取物），或通过免疫沉淀富集，通常样品包括重组蛋白，细胞和组织。
1.样品采集
1）培养细胞
收集粘附细胞和悬浮细胞的方法不同，细胞裂解物的类型也不同。建议裂解含SDS的凝胶上样缓冲液并煮沸。
2）动物组织
与细胞不同，组织块由于体积大而必须预先压碎并匀浆。
2.样品定量
电泳前需要确定蛋白浓度，以确保样品体积一致，这有利于后续的定量或半定量分析。有许多常用的测量蛋白质浓度的方法。它们的灵敏度和所需时间不同，并且不同的干扰物质会影响不同的方法。实验者可以根据样品的制备方法（裂解液组成，去污剂和还原剂的类型等）选择自己的。
几种测定蛋白质浓度的方法的比较
| 优点 | 缺点 | |
| Bradford法 | 迅速、灵敏 | 对各种纯化蛋白质反应不同 |
| BCA法 | 简单、干扰少 | 耗时 |
| Lowry法 | 不同蛋白差别小 | 干扰多，较慢 |
（二）、电泳
电泳分为不可变形的凝胶电泳和变性的凝胶电泳。在不连续缓冲液系统下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）通常用于Western Blotting。在该方法中，将变性的肽与带有负电荷的SDS结合，凝胶电泳中的迁移率仅与肽的分子量有关。凝胶的筛分特性取决于其孔径，孔径是填充过程中使用的丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
| 丙烯酰胺浓度（%） | 线性分离范围（KD） |
| 15 | 12-43 |
| 10 | 16-68 |
| 7.5 | 36-94 |
| 5.0 | 57-212 |
四、Western实验注意事项：
样品制备时
a、尽量避免引入受污染的蛋白质（例如细胞培养液体，蛋白酶抑制剂等）和其他干扰物质；
b、样品浓度应适中，1×SDS凝胶加载缓冲液的推荐剂量为：在10cm2培养皿/0.1ml中添加贴壁细胞，并以5×106细胞/0.1ml的比例添加悬浮细胞；
c、 SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，其浓度应控制在2-10％之间，并根据具体需要进行调整；
d、制备的样品可以在-20℃下保存，但时间不能太长，避免反复冻融，否则蛋白会降解；
e、内部参考对于实验结果非常重要，应选择适当的内部参考。
五、实验所需试剂清单：
| 1 | 丙烯酰胺 | LSH54449 | |
| 2 | N,N′-乙烯基双丙烯酰胺 | JT20613 | |
| 3 | SDS-PAGE蛋白加样缓冲液 | HC1297 | |
| 4 | 90mm*15mm 塑料培养皿(灭菌） | FM-90-X | |
| 5 | 10*10cm方形塑料培养皿(灭菌） | FM-100-F | |
| 6 | SDS溶液 | SS0013 |
