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蛋白质与DNA相互作用实验
Release Time：2020-07-16一、蛋白质与DNA相互作用实验的简单介绍
二，蛋白质与DNA相互作用实验目的：
1.鉴定和分析参与基因表达调控的DNA元素。
2.分离并鉴定这些顺式元素特异性结合的蛋白质因子。
这些问题的研究涉及DNA和蛋白质之间的相互作用。
研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法包括：
1.凝胶阻滞实验。
2. DNase1占用空间实验。
3.甲基化干扰实验。
4.体内足迹测试。
5.下拉实验。
三，凝胶阻滞实验
1.概念：凝胶阻滞测定法（Gelretardationassay），被称为DNA迁移率变动测定法（DNAmobilityshiftassay）或谱带阻滞测定法（Bandretardationassay），是一种特殊的特殊实验，于1980年代初出现，用于研究DNA和蛋白质在体外的相互作用。凝胶电泳技术。
2.原则：
在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子移动到正电极的距离与它们的分子量的对数成反比。如果某个DNA分子与特殊蛋白质结合，由于分子量的增加，其在凝胶中的迁移将被阻止，因此到正电极的距离会相应缩短，因此在凝胶中会出现滞后带，从而是凝胶阻滞实验的基本原理。
3.流程：
首先准备细胞蛋白提取物（理论上含有特殊的转录因子），用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子结合位点），将该标记的探针DNA与细胞蛋白提取物一起孵育，从而生成DNA-蛋白复合物，在保持DNA-蛋白质结合的条件下进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后，进行放射自显影以分析电泳结果4.实验结果分析：
（1）如果放射性标记的条带集中在凝胶底部，则表明细胞提取物中没有可与探针DNA结合的转录因子蛋白。
（2）如果凝胶顶部出现放射性标记的条带，则表明细胞提取物中存在可以与探针DNA结合的转录因子蛋白。
5. DNA竞争实验：
DNA竞争实验（DNA竞争测定）的具体方法如下：
过量的未标记竞争性DNA（competitorDNA）被添加到DNA-蛋白质结合反应系统中。如果它与具有相同转录因子蛋白的探针DNA结合，则竞争性DNA与探针DNA相比将大大过量，因此大多数转录因子蛋白将被竞争性结合，而探针DNA仍处于游离的未结合状态，电泳凝胶带的放射自显影图上将没有阻挡条。
如果添加到反应系统中的竞争性DNA无法与探针DNA竞争以结合相同的转录因子，则电泳凝胶的放射自显影图上会出现一条封闭的条带。
6.申请：
（1）凝胶阻滞实验可用于鉴定特定类型的细胞蛋白提取物中是否存在可与特定DNA结合的转录因子蛋白（包含转录因子结合位点）；
（2）DNA竞争实验可用于检测转录因子蛋白与DNA结合的精确序列部分；
（3）通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变，可以研究这种突变的竞争性能和转录因子结合的作用；
（3）利用DNA与特定转录因子的结合作用，也可以通过亲和色谱法分离特定转录因子。
四，足迹实验
1.定义：
足迹测定法（footprinting assay）是一种特殊的实验方法，用于检测DNA序列的位置以及与特定转录因子蛋白特异性结合的核苷酸序列结构。
2.原则：
当DNA分子的某个片段与特定的转录因子结合时，可以保护它免受DNaseI酶的切割作用，而不会产生相应的切割分子。出现一个空白区域，通常称为“足迹”。
3.流程：
待检测的双链DNA分子在体外5'端用5P标记，并用适当的限制酶切出末端之一，从而获得单链末端标记的双链DNA。在体外同一细胞中的蛋白质提取物（也可以混合核提取物）形成DNA-蛋白质复合物。将少量DNaseI添加到反应混合物中，并控制该数量以实现每个DNA链的平均值，并且仅发生磷酸二酯键的一个断裂：
（1）如果蛋白质提取物中没有与DNA结合的特定蛋白质，则消化DNaseI后，它将从放射性标记的末端产生1个核苷酸，2个核苷酸和3个核苷酸-----等待一系列DNA片段的连续连续梯度，其前后长度相差一个核苷酸。
（2）如果DNA分子与蛋白质提取物中的特定转录因子结合，则可以保护结合位点的DNA免于DNaseI酶的降解。
除去蛋白质，添加样品并在20％序列凝胶上进行电泳分离。实验分为两组：
实验组：DNA +蛋白质混合物
对照组：仅DNA，不与蛋白质提取物一起孵育
最后，进行放射自显影以分析实验结果。
4.结果判断：
实验组中凝胶电泳显示的序列，空白区域表示它是转录因子蛋白结合的部分。与对照组序列相比，可以获得蛋白质结合位点DNA片段的相应核苷酸序列。
5.其他足迹实验方法：
除了DNase1足迹测试外，还开发了其他几种类型的足迹实验，例如：
一个。游离羟基足迹实验； b。菲咯啉铜足迹实验； C。 DMS（硫酸二甲酯）足迹实验
DMS（硫酸二甲酯）足迹实验的原理
DMS可以甲基化DNA分子中的裸鸟嘌呤（G）残基，而六氢吡啶可以特异性地化学裂解甲基化的G残基。如果DNA分子的某个片段与转录因子结合，则可以防止G残基的甲基化被六氢吡啶切割。
五，甲基化干扰实验
1.概念：
甲基化干扰测定法（Methylationinterferenceassay）基于DMS（硫酸二甲酯），可以将DNA分子中的裸鸟嘌呤（G）残基甲基化，六氢吡啶可以使甲基化的G残基。另一种实验方法是根据特异性化学裂解原理设计的，用于研究蛋白质和DNA之间的相互作用。
使用此技术可以检测目标DNA中G残基的优先甲基化，以及它对随后的蛋白质结合有什么影响，从而更详细地揭示DNA-蛋白质相互作用的模式。
2.实验步骤：
用DMS处理目标DNA使其部分甲基化（每个DNA平均仅发生一个G碱基甲基化）与细胞蛋白提取物一起孵育以促进DNA和蛋白的结合
执行凝胶电泳以形成两个目标DNA条带：
（1）没有与蛋白质结合的正常电泳带之一
（2）DNA电泳条带由于两种特定蛋白质的结合而滞后
从凝胶上切下两条DNA电泳带，并用六氢吡啶切开，结果是：
（1）甲基化的G残基被切割：由于转录因子蛋白只能结合到正常的结合位点而没有甲基化，如果转录因子的DNA结合位点序列中的G残基是DMSA。
（2）没有甲基化G残基的靶DNA序列将不被切割。在六氢吡啶裂解后，将结合蛋白质的DNA条带和未结合蛋白质的DNA条带进行凝胶电泳。放射自显影，阅读胶片并分析结果
3.结果判断：
（1）与转录因子蛋白结合的靶DNA序列被六氢吡啶切割并通过电泳分离以显示两条具有空白区域的条带。
（2）被六氢吡啶切割与不同转录因子蛋白结合的靶DNA序列，电泳分离显示三个条带，没有空白区域。
4.申请：
（1）甲基化干扰实验可用于研究转录因子与DNA结合位点G残基之间的关系。
（2）是足迹实验的有效补充方法，可以确定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。
5.缺点：
DMS只能甲基化DNA序列中的G和A残基，而不能甲基化T和C残基。
六，体内足迹实验
上面讨论的三种研究转录因子和DNA相互作用的方法都有一个共同的缺点，那就是它们是在体外进行的实验。因此，人们将考虑这些实验的结果是否可以反映细胞中发生的现实生活过程。即，DNA和蛋白质之间的实际相互作用发生在细胞中。
1.实验原则：
原则上，体内足迹测试的原理与体外DMS足迹测试没有区别，即：
（1）DMS可以甲基化G残基。（2）六氢吡啶可以特异性切割甲基化的G残基。（3）由于对蛋白质的保护，与特异性转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基不会被DMS甲基化，因此不会被六氢吡啶切割。
（4）与对照的裸DNA形成的梯子相比，发现活细胞DNA形成的梯子缺少相应的条带，其中G残基未被切割。2.流程：
用有限量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，以使渗透到细胞中的DMS浓度仅引起天然染色体DNA G残基的甲基化
从经过DMS处理的细胞中提取DNA，并添加六氢吡啶以进行体外消化
PCR扩增后，通过凝胶电泳对其进行分析，因为克隆的DNA片段已在体外实验中大量使用，而从染色体DNA分离出的任何特定DNA均已在体内足迹实验中使用。该量微不足道，因此需要通过PCR进行扩增以获得足够量的特异性DNA放射自显影，读取载玻片并记录其结果
3.结果判断：
（1）能够与转录因子蛋白结合的DNA片段中的G片段不受DMS甲基化的影响，并且避免了六氢吡啶的裂解；
（2）在体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化并被六氢吡啶切割。
6.下拉测定法（Pull-downassay）
下拉实验也称为蛋白质体外结合实验（bindingassayinvitro），是一种用于检测试管中蛋白质之间相互作用的方法。基本原理是重组编码基因和诱饵蛋白编码基因的小肽（如生物素，6-His标签和谷胱甘肽转移酶等），并将其表达为融合蛋白。分离纯化融合蛋白，将其与磁珠结合成固相，然后与表达目标蛋白的细胞提取液混合并孵育适当的时间，例如，在4℃孵育过夜，使目标蛋白固定在磁珠的表面上。融合蛋白中的诱饵蛋白被完全结合。
七、实验所需试剂
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | L-谷胱甘肽（氧化型） | SY0302 | 27025-41-8 | |
| 2 | DMS | SY0223 | 75-18-3 | |
| 3 | 鸟嘌呤 | SY0332 | 73-40-5 | |
| 4 | 脱氧核糖核酸 钠盐 | SS1023 | 68938-01-2 |
