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（法匹拉韦三磷酸）T-705核糖基三磷酸对流感病毒RNA聚合酶的作用机理
Release Time：2020-06-01 T-705（favipiravir; 6-氟-3-羟基-2-吡嗪甲酰胺）在体内和体外选择性并强烈抑制流感病毒的复制。已显示T-705可通过细胞内酶转化为T-705-4-核呋喃呋喃糖基-5-三磷酸（T-705RTP），然后用作核苷酸类似物以选择性抑制流感的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）病毒。为了阐明这些抑制机理，我们使用Lineweaver-Burk图对四种天然三磷酸核苷进行了酶动力学抑制分析，并对从32P-放射性标记的5'Cap1 RNA启动的引物延伸产物进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳。酶动力学分析表明，T-705RTP以竞争性方式抑制了ATP和GTP的掺入，这表明T-705RTP被流感病毒RdRp识别为嘌呤核苷酸，并抑制了非竞争性和混合型UTP和CTP的掺入。礼节。引物延伸分析表明，T-705RTP的一个分子被掺入了流感病毒的新生RNA链中，并抑制了随后核苷酸的掺入。这些结果表明，即使T-705RTP的天然核糖具有3'-OH基团，T-705RTP的单个分子也作为嘌呤核苷酸类似物掺入新生的RNA链中，并抑制链的延伸。与磷酸基团的共价键。
自古以来，流感病毒已经夺走了许多生命，仍然是对人类的严重威胁。流感病毒进入人体，与细胞表面糖蛋白的唾液酸结合，然后被内吞进入细胞，在那里它们将病毒RNA和RNA结合的蛋白复合物（RNP）释放到细胞质中（脱壳）。释放到细胞质中的RNP进入细胞核，并被流感病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）转录和复制。随后，翻译的病毒蛋白，即血凝素，神经氨酸酶和M2蛋白，随新生的RNP迁移到细胞表面。然后通过神经氨酸酶构建病毒颗粒并从细胞膜中释放出来。常规的抗流感病毒药物靶向上述流感病毒的任何一种增殖过程。例如，抑制病毒释放的M2通道抑制剂（例如金刚烷胺）和抑制病毒释放的神经氨酸酶抑制剂（例如oseltamivir和zanamivir）被用作抗流感病毒药物（1）。但是，对于神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺，已经报道了抗性病毒（2，3）。因此，需要开发具有不同作用机理的新型抗流感病毒剂。 T-705（favipiravir； 6-氟-3-羟基-2-吡嗪甲酰胺）是由Toyama Chemical Co.，Ltd.开发的新型抗流感病毒制剂（图1）（4-6）。 T-705与金刚烷胺和神经氨酸酶抑制剂具有不同的特性。 T-705强烈抑制A，B和C型流感病毒的复制，并具有针对各种RNA病毒的广谱活性，如arenaviridae，bunyaviridae，flaviviridae，picornaviridae和paramyxoviridae（4、7-11）。 T-705目前正在美国进行II期临床试验，用于治疗流感病毒感染。另外，与神经氨酸酶抑制剂相比，T-705去除药剂后病毒再生的可能性较小。与神经氨酸酶抑制剂的联合治疗具有协同作用（6、12、13）。此外，在存在各种浓度的T-705的情况下，直到完成30代传代后，才产生抗药性病毒，这表明T-705不太可能引起抗药性病毒（4；未发表的数据）。 T-705特有的上述有利特性可能是由其作用机理引起的。我们先前证明，在嘌呤核酸存在下，T-705的体外抗流感病毒活性降低，表明T-705可能作为核碱基类似物诱导抗病毒活性（5）。此外，我们证明了T-705转化为T-705-4-核呋喃糖基-5-单磷酸（T-705RMP），然后又转化为T-705-4-核呋喃糖基-5-三磷酸（T-705RTP；图1 ），然后选择性抑制流感病毒的RdRp（5，14）。流感病毒RdRp由三个亚基（PA，PB1和PB2）组成，在受感染细胞的核中转录并复制病毒RNA。它的转录包括称为封顶抢夺的特定过程。具体地，通过流感病毒RdRp的核酸内切酶功能将包含宿主mRNA的5'Cap1结构的9至15个核苷酸（nt）片段切除，以用作转录引物。另一方面，其复制不需要引物。后代vRNA是通过cRNA合成的（15）。为了阐明作为T-705活性形式的T-705RTP的抑制机制，我们在本文中分析了酶动力学，并使用具有人工5'Cap1结构的mRNA片段代替了宿主mRNA进行了引物延伸分析。
T-705RTP（6-氟-3,4-二氢-4- [5-O-（羟基{[羟基（[羟基（膦酰基氧基）膦基]氧基}膦基]）-β-d-呋喃呋喃糖基）-3-氧代-2-吡嗪甲酰胺）
制备粗流感病毒RdRp。
将MDCK细胞以每个培养皿3×106个细胞的形式接种到100 mm平板中，并在37°C的5％CO2中孵育过夜。在7毫升/皿的含有1％牛血清白蛋白，3％维生素（Life Technologies，Carlsbad，CA）和3μgTPCK（甲苯磺酰基苯丙氨酰）的EMEM培养基中，用流感病毒（感染复数= 0.001）感染细胞。 （氯甲基酮）胰蛋白酶/ ml，在35°C，5％CO2中培养2天。通过超速离心（50,860×g在4°C下2.5 h）收集培养上清液（?300 ml），并保存在1-2 ml的含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM EDTA和直到在-80°C下使用100 mM NaCl。通过暴露于去污剂（200 mM Tris-HCl [pH 8.0]，200 mM KCl，10 mM MgCl2、3 mM二硫苏糖醇[DTT]，10％[wt / vol]甘油，3％[vol / vol]使用Triton N-101和2％（wt / vol）LPC（5）作为含有病毒RNA基因组的粗流感病毒RdRp。
ApG引发的RNA聚合酶活性的测量。
在所有实验中，将2μl（0.1μg）粗流感病毒RdRp在30μl含100 mM Tris-HCl（pH 8.0），100 mM KCl，5 mM MgCl2的转录缓冲液中于30°C孵育1小时。 ，1 mM DTT，4μgtRNA / ml和0.25（vol / vol）％的Triton N-101。向粗制流感病毒RdRp添加0.25 mM二核苷酸ApG，100μMATP，50μMCTP，50μMUTP，1μMGTP，0.028μM（2.5μCi）[α-32P] GTP（3,000 Ci / mmol; Perkin-Elmer （Inc.，Inc.，Waltham，MA）和T-705RTP进行GTP掺入分析（5）。在UTP掺入分析中，向粗流感病毒RdRp添加0.25 mM二核苷酸ApG，100μMATP，50μMCTP，50μMGTP，0.75μMUTP和0.25μM[5,6-3H] UTP（35 Ci / ； Perkin-Elmer）。将反应混合物在浸泡在500mM EDTA中的DE81过滤器（Whatman Japan，Ltd.，Tokyo，Japan）上过滤。干燥滤膜，用5％Na2HPO4（pH 10.4）洗涤3次，每次10分钟，然后用蒸馏水冲洗两次，每次5分钟，再用甲醇冲洗一次。将过滤器空气干燥，并用Tri-Carb 3110TR液体闪烁计数器（Perkin-Elmer）在10 ml Ultima Gold（Perkin-Elmer）中测量放射性。使用SAS分析软件（8.2版；日本东京的SAS Institute，Ltd。）通过逻辑曲线拟合计算50％抑制浓度（IC 50）。在与上述相同的条件下进行ATP，CTP，GTP和UTP的动力学分析。核苷酸的浓度示于表1。将数据拟合到Lineweaver-Burk图以进行动力学分析。所有结果均表示为平均值±一式三份实验的标准偏差（SD）。
自古以来，流感病毒已经夺走了许多生命，仍然是对人类的严重威胁。流感病毒进入人体，与细胞表面糖蛋白的唾液酸结合，然后被内吞进入细胞，在那里它们将病毒RNA和RNA结合的蛋白复合物（RNP）释放到细胞质中（脱壳）。释放到细胞质中的RNP进入细胞核，并被流感病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）转录和复制。随后，翻译的病毒蛋白，即血凝素，神经氨酸酶和M2蛋白，随新生的RNP迁移到细胞表面。然后通过神经氨酸酶构建病毒颗粒并从细胞膜中释放出来。常规的抗流感病毒药物靶向上述流感病毒的任何一种增殖过程。例如，抑制病毒释放的M2通道抑制剂（例如金刚烷胺）和抑制病毒释放的神经氨酸酶抑制剂（例如oseltamivir和zanamivir）被用作抗流感病毒药物（1）。但是，对于神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺，已经报道了抗性病毒（2，3）。因此，需要开发具有不同作用机理的新型抗流感病毒剂。 T-705（favipiravir； 6-氟-3-羟基-2-吡嗪甲酰胺）是由Toyama Chemical Co.，Ltd.开发的新型抗流感病毒制剂（图1）（4-6）。 T-705与金刚烷胺和神经氨酸酶抑制剂具有不同的特性。 T-705强烈抑制A，B和C型流感病毒的复制，并具有针对各种RNA病毒的广谱活性，如arenaviridae，bunyaviridae，flaviviridae，picornaviridae和paramyxoviridae（4、7-11）。 T-705目前正在美国进行II期临床试验，用于治疗流感病毒感染。另外，与神经氨酸酶抑制剂相比，T-705去除药剂后病毒再生的可能性较小。与神经氨酸酶抑制剂的联合治疗具有协同作用（6、12、13）。此外，在存在各种浓度的T-705的情况下，直到完成30代传代后，才产生抗药性病毒，这表明T-705不太可能引起抗药性病毒（4；未发表的数据）。 T-705特有的上述有利特性可能是由其作用机理引起的。我们先前证明，在嘌呤核酸存在下，T-705的体外抗流感病毒活性降低，表明T-705可能作为核碱基类似物诱导抗病毒活性（5）。此外，我们证明了T-705转化为T-705-4-核呋喃糖基-5-单磷酸（T-705RMP），然后又转化为T-705-4-核呋喃糖基-5-三磷酸（T-705RTP；图1 ），然后选择性抑制流感病毒的RdRp（5，14）。流感病毒RdRp由三个亚基（PA，PB1和PB2）组成，在受感染细胞的核中转录并复制病毒RNA。它的转录包括称为封顶抢夺的特定过程。具体地，通过流感病毒RdRp的核酸内切酶功能将包含宿主mRNA的5'Cap1结构的9至15个核苷酸（nt）片段切除，以用作转录引物。另一方面，其复制不需要引物。后代vRNA是通过cRNA合成的（15）。为了阐明作为T-705活性形式的T-705RTP的抑制机制，我们在本文中分析了酶动力学，并使用具有人工5'Cap1结构的mRNA片段代替了宿主mRNA进行了引物延伸分析。
T-705RTP（6-氟-3,4-二氢-4- [5-O-（羟基{[羟基（[羟基（膦酰基氧基）膦基]氧基}膦基]）-β-d-呋喃呋喃糖基）-3-氧代-2-吡嗪甲酰胺）
制备粗流感病毒RdRp。
将MDCK细胞以每个培养皿3×106个细胞的形式接种到100 mm平板中，并在37°C的5％CO2中孵育过夜。在7毫升/皿的含有1％牛血清白蛋白，3％维生素（Life Technologies，Carlsbad，CA）和3μgTPCK（甲苯磺酰基苯丙氨酰）的EMEM培养基中，用流感病毒（感染复数= 0.001）感染细胞。 （氯甲基酮）胰蛋白酶/ ml，在35°C，5％CO2中培养2天。通过超速离心（50,860×g在4°C下2.5 h）收集培养上清液（?300 ml），并保存在1-2 ml的含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM EDTA和直到在-80°C下使用100 mM NaCl。通过暴露于去污剂（200 mM Tris-HCl [pH 8.0]，200 mM KCl，10 mM MgCl2、3 mM二硫苏糖醇[DTT]，10％[wt / vol]甘油，3％[vol / vol]使用Triton N-101和2％（wt / vol）LPC（5）作为含有病毒RNA基因组的粗流感病毒RdRp。
ApG引发的RNA聚合酶活性的测量。
在所有实验中，将2μl（0.1μg）粗流感病毒RdRp在30μl含100 mM Tris-HCl（pH 8.0），100 mM KCl，5 mM MgCl2的转录缓冲液中于30°C孵育1小时。 ，1 mM DTT，4μgtRNA / ml和0.25（vol / vol）％的Triton N-101。向粗制流感病毒RdRp添加0.25 mM二核苷酸ApG，100μMATP，50μMCTP，50μMUTP，1μMGTP，0.028μM（2.5μCi）[α-32P] GTP（3,000 Ci / mmol; Perkin-Elmer （Inc.，Inc.，Waltham，MA）和T-705RTP进行GTP掺入分析（5）。在UTP掺入分析中，向粗流感病毒RdRp添加0.25 mM二核苷酸ApG，100μMATP，50μMCTP，50μMGTP，0.75μMUTP和0.25μM[5,6-3H] UTP（35 Ci / ； Perkin-Elmer）。将反应混合物在浸泡在500mM EDTA中的DE81过滤器（Whatman Japan，Ltd.，Tokyo，Japan）上过滤。干燥滤膜，用5％Na2HPO4（pH 10.4）洗涤3次，每次10分钟，然后用蒸馏水冲洗两次，每次5分钟，再用甲醇冲洗一次。将过滤器空气干燥，并用Tri-Carb 3110TR液体闪烁计数器（Perkin-Elmer）在10 ml Ultima Gold（Perkin-Elmer）中测量放射性。使用SAS分析软件（8.2版；日本东京的SAS Institute，Ltd。）通过逻辑曲线拟合计算50％抑制浓度（IC 50）。在与上述相同的条件下进行ATP，CTP，GTP和UTP的动力学分析。核苷酸的浓度示于表1。将数据拟合到Lineweaver-Burk图以进行动力学分析。所有结果均表示为平均值±一式三份实验的标准偏差（SD）。
| 序列 | 货号 | 产品名 | 备注 |
| 1 | HCQ000049 | T-705RTP | |
| 2 | HCQ000047 | T-705RMP | |
| 3 | HCQ000106 | T-705RTP Free acid | |
| 4 | HCQ000100 | T-705 Ribofuranose | |
| 5 | HCQ000001 | Favipiravir |
