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钙离子成像原料？钙荧光探针实验注意事项

钙（Ca2+）是一种重要离子，在多种细胞功能中发挥作用。作为一个小离子，它可以在细胞质和细胞隔室中自由快速移动。Ca2+可以作为从肌肉细胞（肌细胞）到神经元和其他许多细胞活动的快速指示剂。该领域的工作可以追溯到20世纪70年代Roger Tsien及其合作者在EGTA的Ca2+螯合特性方面的开创性工作。在此后的几年里，钙指示剂（Ca2+指示剂）的发展继续为细胞生物学的基础提供了深刻的见解，例如，细胞在不同疾病状态下的反应，或对治疗药物的反应。在本文中，我们将研究用于监测钙信号、局部钙水平的不同荧光指示剂，并研究它们在细胞和隔室中的流量或空间动态。

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单波长钙测量

使用最方便、最快的Ca2+指示剂是单波长染料。这些通常用于指示活动，它们对共焦成像更友好，因为它们通常与常见的激发和发射波长以及光源相匹配。

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Fluo-4相对明亮且稳定，因此可以在较短的曝光时间内获得强信号，并且光毒性最小，因为它也不需要产生更多活性氧的紫外线波长。Fluo-4是一种低亲和力的Ca2+指示剂，这意味着它可以在饱和前测量高Ca2+浓度，但在低Ca2+浓度（如静息细胞的Ca2+浓度）下测量效果不佳。在单波长测量中，通常使用比率F（t）/F（0）比较活动期间的荧光发射与静止状态的荧光发射。Ca2+浓度的定性测量可以通过这种方式实现，但这对定量测量造成了限制，需要对数据进行归一化，以解释实验内和实验间的变化。潜在问题包括研究期间细胞的染料负载不均匀、光漂白和染料从细胞中泄漏。

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Rhod Dyes 
另一组单波长Ca2+指示剂是Rhod染料。虽然应用不太广泛，但值得注意的是，它们将激发和发射转移到更长的波长。例如，X-rhod-1的激发波长为580 nm，发射波长为600 nm。这种波长向红色偏移的原理有助于减少组织内的光毒性、自体荧光和光散射效应，因此红色区域的Ca2+指示剂数量继续增加。在更长波长下工作的另一个好处是允许与其他荧光蛋白标记进行多路复用，或者可能促进使用通道视紫红质对膜电位的光遗传学控制（Lock et al.，2015）。

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细胞内钙Fura-2，Indo-1的比例染料

定量染料对定量工作很有用，因为它们可以校正成像条件和样品制备中的许多变化，例如染料浓度的变化或光漂白效应。这允许在不同实验之间对数据进行校准和标准化。比例Ca2+指示剂的发射光谱或吸收光谱随着局部Ca2+浓度的变化而发生变化。这些染料的乙酰甲氧基（AM）酯化形式是首选的，因为它们在细胞膜上扩散，并被细胞内酯酶裂解，使细胞装载过程更容易和有效。

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Fura-2
在所有比例钙离子指示剂中，Fura-2最为著名。Fura-2在340 nm和380 nm处表现出不同的吸收，这是Ca2+的函数（见下图）。通过510nm左右的相对发射强度可以检测到这种变化。

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因此，Fura-2的成像协议比单波长Ca2+指示剂的成像协议更复杂，并且需要能够在340 nm和380 nm处提供照明的光源。Fura-2成像需要340 nm和380 nm的连续照明，检测波长为510 nm，然后计算这对发射图像的像素比率。通过对自由离子浓度进行校准，可以进一步分析图像。Fura-2对Ca2+具有很高的亲和力，因此非常适合在低水平下精确定量测量Ca2+，但不适用于非常高的浓度（通常高于1μM）。然而，有一些Fura-2染料的亲和力较低，可以在较高的Ca2+浓度下进行测量。

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Indo-1
另一种著名的比例染料是Indo-1，但在这种情况下，染料在405 nm和485 nm处的两个峰值附近改变其发射效率。Indo-1的激发波长约为340 nm，可以用以405 nm和485 nm发射峰为中心的滤光片依次成像。

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与Fura-2一样，图像是像素级的，可以根据游离Ca2+浓度进行校准。Indo-1的一个潜在问题是，在某些实验条件下，它可能相对不稳定。它通常用于流式细胞术测量，而这不是问题。