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常用的荧光探针
Release Time：2022-03-01常用的荧光探针：市场上不同的探针，要确定给定实验的最佳 DNA 染料可能有点困难。 为了简化这个过程，以下是我们认为的 10 种最佳 DNA 染料。
溴化乙锭 (EtBr)
特点：
※ 便宜
※ 简单
※ 成熟的产品
※ 橙色荧光
溴化乙锭 (EtBr) 是最流行的 DNA 染料之一。这是因为它是最早商业化的产品之一。早在1950年代，它就被用来治疗牲畜的疾病。 1970 年代，科学家开始将其用作 DNA 探针。除了早期采用之外，溴化乙锭相对便宜。即使是大批量，它仍然非常实惠，每克大约 30 美元，但根据供应商和包装尺寸，价格可能会大大提高或降低。溴化乙锭非常适合琼脂糖凝胶电泳中的 DNA 染色。它还可用于检测 PCR 中的 dsDNA。与 DNA 结合后，EtBr 的亮度增加了大约 20 倍。当被紫外光（~300 nm）激发时，它会释放橙色荧光（605 nm）。溴化乙锭还可以根据 RNA 折叠发生的程度检测 RNA。然而，溴化乙锭并不是检测活细胞中 DNA 的良好探针。这是因为它不能渗透完整的细胞膜。多年来，溴化乙锭的使用引起了健康问题。特别是，由于溴化乙锭是一种嵌入剂，人们对溴化乙锭作为诱变剂的作用提出了担忧。这引发了关于溴化乙锭是否最适合常规实验室使用的激烈争论。但截至目前，还没有研究支持这一说法。当大量暴露时，溴化乙锭可能会干扰人类的 DNA 复制和转录。在低浓度时，它不被视为危险废物。
碘化丙啶（PI）
碘化丙啶是一种 DNA 染料和嵌入剂。它与溴化乙锭属于同一化学家族。与溴化乙锭一样，碘化丙锭具有形成其核心的含氮环结构。它的不同之处在于它具有额外的季胺，该季胺与碘离子离子结合。与 DNA 结合后，碘化丙啶的荧光会增加 20-30 倍。如果发生折叠，它也可以与 RNA 结合。碘化丙啶是不透膜的。它只能进入细胞膜受损的细胞。这使其成为识别死细胞的绝佳探针。它还可用于定量评估生物样本中的 DNA 含量。碘化丙啶没有序列偏好，大约每 4-5 个碱基对结合一次。它可以被氙灯或汞灯以及 488 nm 氩离子激光器激发。由于其发射波长为 617 nm，因此可以轻松用于多重分析。可与荧光素等绿色荧光探针结合使用。它也可以用作多色分析的复染剂。在价格方面，它明显比溴化乙锭贵（每克约 1000 美元）。然而，它是流式细胞术中非常常见的染料。也可用于荧光显微术和荧光光谱学。
结晶紫 Crystal Violet
结晶紫是一种简单的化合物，由连接到三个胺的三个键合苯环组成。它长期以来一直用于各种医疗目的，既可用作抗菌剂，也可用作局部防腐剂。它作为组织学染色剂的使用历史也很悠久，早期的使用可以追溯到 1800 年代后期。结晶紫可能最为人所知的是它在革兰氏染色中的用途，以确定细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性。作为DNA染料，结晶紫可用于凝胶电泳中的核酸检测。在这些应用中，它可以替代溴化乙锭等荧光染色试剂。这是一个特别强大的优势，因为使用紫外光源激发荧光探针可能会导致 DNA 降解。然而，结晶紫的这种应用的代价是灵敏度的损失。在实验中，结晶紫对 DNA 的敏感性低于溴化乙锭等荧光探针。溴化乙锭可以检测凝胶条带中低至 1 ng 的 DNA，而结晶紫的灵敏度约为 16 ng。如果使用复染剂（例如甲基橙），这种灵敏度可以提高到 8 ng。但是，它仍然不如溴化乙锭敏感。在定价方面，结晶紫非常实惠。它也相当无毒。如果健康问题是一个问题，结晶紫可以作为一些更危险的化合物（如溴化乙锭）的无毒替代品。
dUTP 偶联探针
※ 聚合酶链反应
dUTP 共轭探针形成了一类有趣的 DNA 检测器，主要是由于它们提供的实验灵活性。 基本思想是使用所谓的链接器将探针附加到 dUTP。 然后，通过分子技术将 dUTP 整合到 DNA 中。 这也将探针结合到 DNA 大分子中。 通过这种方式，DNA 被探针标记。 因为 dUTP 可以与许多不同的探针偶联，所以 dUTP 偶联物具有广泛的潜在应用。 例如，dUTP 探针可用于监测 PCR 反应。 它们也可以用作 FISH 程序中的探针。 一般来说，dUTP 探针在发生 DNA 杂交的情况下表现出色。 一些最常见的 dUTP 偶联物包括用地高辛 (DIG)、生物素和荧光素等化合物进行标记。 用这些化合物进行标记都为 DNA 检测提供了非放射性探针。 特别是这些探针还发现广泛用于免疫测定，如 ELISA。
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）
DAPI像许多染料一样，DAPI 最初是作为药物合成的。它最初用于治疗锥虫病，一种由寄生虫引起的疾病。在 1970 年代后期，由于 DAPI 在结合 DNA 方面的功效以及随后的荧光大幅增加，DAPI 被用作 DNA 探针。 DAPI 与双链 DNA 的富含 A-T 的区域结合得特别强烈，并且在结合时会经历大约 20 倍的荧光增加。它也可以与 RNA 结合，但荧光增强较弱且发射红移。 DAPI 常用于荧光显微术。它在染色死细胞或膜受损细胞方面特别成功。 DAPI 可以通过完整的细胞膜，尽管很困难。因此，不建议用于活细胞染色。 DAPI 的激发波长为 358 nm，发射波长为 461 nm。这意味着当使用蓝色/青色滤镜进行可视化时，它将显示为蓝色。它也可以与绿色荧光探针如 GFP 结合使用。在实验中，DAPI 具有很高的细胞毒性，这强化了避免使用 DAPI 进行活细胞染色的原因。如果发生接触，DAPI 对人类是相当无毒的。然而，与许多 DNA 探针一样，DAPI 可能具有一些诱变特性。
7-AAD（7-氨基放线菌素 D）
7-AAD 是一种荧光探针和嵌入剂。 与 DAPI 一样，它对结合双链 DNA 具有很强的亲和力。 与与富含 A-T 的区域结合的 DAPI 不同，7-AAD 选择性地与富含 G-C 的区域结合。 它还会与 RNA 结合，因此在染色前可能需要消化酶。 7-AAD 的激发波长为 546 nm，发射波长为 647 nm。 由于其较大的斯托克斯位移，许多研究人员将 7-AAD 与蓝色和绿色荧光探针结合使用进行多色分析。 543 nm 氦氖激光器很好地激发了 7-AAD。 7-AAD 适用于检测死细胞群或膜受损的细胞。 它不容易通过完整的膜，使其成为活细胞的不良染色剂。 7-AAD 已在荧光显微镜和流式细胞术中得到广泛应用。
※ 活细胞
※ 透膜
※ 低细胞毒性
※ A-T 序列偏好
※ 氙汞灯
※ 紫外激光
※ 荧光显微镜
※ 流式细胞仪
Hoechst 染料是一组蓝色荧光 DNA 探针。早在 1970 年代，它们就已被用于对 DNA 进行染色。这些染料由德国公司 Hoechst AG 开发，是传统蓝色荧光染料的良好替代品。与 DAPI 等类似染料相比，Hoechst 染料提供显着更高的细胞渗透性。这意味着 Hoechst 染料（例如 Hoechst 33258）适用于对活细胞和死细胞进行染色。此外，由于 Hoechst 染料的细胞毒性较低，因此对活细胞群的影响也大大降低。 Hoechst 染料将选择性地结合双链 DNA 的富含 A-T 的区域，特异性结合小沟。与 DNA 结合后，Hoechst 染料的荧光强度会增加约 30 倍。 Hoechst 染料可被紫外光（~360 nm）激发并发出蓝色荧光（~460 nm）。这些染料与氙汞灯以及紫外激光器兼容。它们非常适用于荧光显微镜、免疫组织化学和流式细胞术。 Hoechst 33258、33342 和 34580 之间的区别很重要。与 Hoechst 33258 相比，由于添加了亲油性乙基，Hoechst 33342 的渗透性明显更高。对于 Hoechst 34580，与 Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 的 461 nm 发射最大值相比，发射最大值略微蓝移，位于 437 nm。
YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1
YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1是基于化合物恶唑黄的花青染料系列。然而，尽管名称如此，这些染料实际上发出绿色而不是黄色的荧光。例如，YOYO-1（及其化学等价物 DiYO-1）的最大发射波长为 509 nm。 TOTO-1（及其化学等价物 DiTO-1）也是如此；该化合物的最大发射波长为 535 nm。这些化合物是嵌入剂，这意味着它们将自己插入 DNA 碱基对的平面之间。这个 DNA 探针家族以其对 DNA 的高亲和力而闻名。与 DNA 结合后，这些探针的荧光可以增加一千到三千倍。这种对 DNA 的强烈亲和力使它们非常适合需要高灵敏度的实验。不过，代价是这些探头相当昂贵。一毫升可能要花费数千美元。因为这些探针是细胞不可渗透的，它们不能穿过完整的细胞膜。它们非常适合染色固定或死细胞。在这方面，这些探针通常与流式细胞仪等平台一起用于细胞活力和细胞毒性测定。
溴化乙锭 (EtBr)
特点：
※ 便宜
※ 简单
※ 成熟的产品
※ 橙色荧光
溴化乙锭 (EtBr) 是最流行的 DNA 染料之一。这是因为它是最早商业化的产品之一。早在1950年代，它就被用来治疗牲畜的疾病。 1970 年代，科学家开始将其用作 DNA 探针。除了早期采用之外，溴化乙锭相对便宜。即使是大批量，它仍然非常实惠，每克大约 30 美元，但根据供应商和包装尺寸，价格可能会大大提高或降低。溴化乙锭非常适合琼脂糖凝胶电泳中的 DNA 染色。它还可用于检测 PCR 中的 dsDNA。与 DNA 结合后，EtBr 的亮度增加了大约 20 倍。当被紫外光（~300 nm）激发时，它会释放橙色荧光（605 nm）。溴化乙锭还可以根据 RNA 折叠发生的程度检测 RNA。然而，溴化乙锭并不是检测活细胞中 DNA 的良好探针。这是因为它不能渗透完整的细胞膜。多年来，溴化乙锭的使用引起了健康问题。特别是，由于溴化乙锭是一种嵌入剂，人们对溴化乙锭作为诱变剂的作用提出了担忧。这引发了关于溴化乙锭是否最适合常规实验室使用的激烈争论。但截至目前，还没有研究支持这一说法。当大量暴露时，溴化乙锭可能会干扰人类的 DNA 复制和转录。在低浓度时，它不被视为危险废物。
碘化丙啶（PI）
碘化丙啶是一种 DNA 染料和嵌入剂。它与溴化乙锭属于同一化学家族。与溴化乙锭一样，碘化丙锭具有形成其核心的含氮环结构。它的不同之处在于它具有额外的季胺，该季胺与碘离子离子结合。与 DNA 结合后，碘化丙啶的荧光会增加 20-30 倍。如果发生折叠，它也可以与 RNA 结合。碘化丙啶是不透膜的。它只能进入细胞膜受损的细胞。这使其成为识别死细胞的绝佳探针。它还可用于定量评估生物样本中的 DNA 含量。碘化丙啶没有序列偏好，大约每 4-5 个碱基对结合一次。它可以被氙灯或汞灯以及 488 nm 氩离子激光器激发。由于其发射波长为 617 nm，因此可以轻松用于多重分析。可与荧光素等绿色荧光探针结合使用。它也可以用作多色分析的复染剂。在价格方面，它明显比溴化乙锭贵（每克约 1000 美元）。然而，它是流式细胞术中非常常见的染料。也可用于荧光显微术和荧光光谱学。
结晶紫 Crystal Violet
结晶紫是一种简单的化合物，由连接到三个胺的三个键合苯环组成。它长期以来一直用于各种医疗目的，既可用作抗菌剂，也可用作局部防腐剂。它作为组织学染色剂的使用历史也很悠久，早期的使用可以追溯到 1800 年代后期。结晶紫可能最为人所知的是它在革兰氏染色中的用途，以确定细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性。作为DNA染料，结晶紫可用于凝胶电泳中的核酸检测。在这些应用中，它可以替代溴化乙锭等荧光染色试剂。这是一个特别强大的优势，因为使用紫外光源激发荧光探针可能会导致 DNA 降解。然而，结晶紫的这种应用的代价是灵敏度的损失。在实验中，结晶紫对 DNA 的敏感性低于溴化乙锭等荧光探针。溴化乙锭可以检测凝胶条带中低至 1 ng 的 DNA，而结晶紫的灵敏度约为 16 ng。如果使用复染剂（例如甲基橙），这种灵敏度可以提高到 8 ng。但是，它仍然不如溴化乙锭敏感。在定价方面，结晶紫非常实惠。它也相当无毒。如果健康问题是一个问题，结晶紫可以作为一些更危险的化合物（如溴化乙锭）的无毒替代品。
dUTP 偶联探针
※ 聚合酶链反应
dUTP 共轭探针形成了一类有趣的 DNA 检测器，主要是由于它们提供的实验灵活性。 基本思想是使用所谓的链接器将探针附加到 dUTP。 然后，通过分子技术将 dUTP 整合到 DNA 中。 这也将探针结合到 DNA 大分子中。 通过这种方式，DNA 被探针标记。 因为 dUTP 可以与许多不同的探针偶联，所以 dUTP 偶联物具有广泛的潜在应用。 例如，dUTP 探针可用于监测 PCR 反应。 它们也可以用作 FISH 程序中的探针。 一般来说，dUTP 探针在发生 DNA 杂交的情况下表现出色。 一些最常见的 dUTP 偶联物包括用地高辛 (DIG)、生物素和荧光素等化合物进行标记。 用这些化合物进行标记都为 DNA 检测提供了非放射性探针。 特别是这些探针还发现广泛用于免疫测定，如 ELISA。
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）
DAPI像许多染料一样，DAPI 最初是作为药物合成的。它最初用于治疗锥虫病，一种由寄生虫引起的疾病。在 1970 年代后期，由于 DAPI 在结合 DNA 方面的功效以及随后的荧光大幅增加，DAPI 被用作 DNA 探针。 DAPI 与双链 DNA 的富含 A-T 的区域结合得特别强烈，并且在结合时会经历大约 20 倍的荧光增加。它也可以与 RNA 结合，但荧光增强较弱且发射红移。 DAPI 常用于荧光显微术。它在染色死细胞或膜受损细胞方面特别成功。 DAPI 可以通过完整的细胞膜，尽管很困难。因此，不建议用于活细胞染色。 DAPI 的激发波长为 358 nm，发射波长为 461 nm。这意味着当使用蓝色/青色滤镜进行可视化时，它将显示为蓝色。它也可以与绿色荧光探针如 GFP 结合使用。在实验中，DAPI 具有很高的细胞毒性，这强化了避免使用 DAPI 进行活细胞染色的原因。如果发生接触，DAPI 对人类是相当无毒的。然而，与许多 DNA 探针一样，DAPI 可能具有一些诱变特性。
7-AAD（7-氨基放线菌素 D）
7-AAD 是一种荧光探针和嵌入剂。 与 DAPI 一样，它对结合双链 DNA 具有很强的亲和力。 与与富含 A-T 的区域结合的 DAPI 不同，7-AAD 选择性地与富含 G-C 的区域结合。 它还会与 RNA 结合，因此在染色前可能需要消化酶。 7-AAD 的激发波长为 546 nm，发射波长为 647 nm。 由于其较大的斯托克斯位移，许多研究人员将 7-AAD 与蓝色和绿色荧光探针结合使用进行多色分析。 543 nm 氦氖激光器很好地激发了 7-AAD。 7-AAD 适用于检测死细胞群或膜受损的细胞。 它不容易通过完整的膜，使其成为活细胞的不良染色剂。 7-AAD 已在荧光显微镜和流式细胞术中得到广泛应用。
Hoechst 33258 (Hoechst 33342, Hoechst 34580)
※ 蓝色荧光※ 活细胞
※ 透膜
※ 低细胞毒性
※ A-T 序列偏好
※ 氙汞灯
※ 紫外激光
※ 荧光显微镜
※ 流式细胞仪
Hoechst 染料是一组蓝色荧光 DNA 探针。早在 1970 年代，它们就已被用于对 DNA 进行染色。这些染料由德国公司 Hoechst AG 开发，是传统蓝色荧光染料的良好替代品。与 DAPI 等类似染料相比，Hoechst 染料提供显着更高的细胞渗透性。这意味着 Hoechst 染料（例如 Hoechst 33258）适用于对活细胞和死细胞进行染色。此外，由于 Hoechst 染料的细胞毒性较低，因此对活细胞群的影响也大大降低。 Hoechst 染料将选择性地结合双链 DNA 的富含 A-T 的区域，特异性结合小沟。与 DNA 结合后，Hoechst 染料的荧光强度会增加约 30 倍。 Hoechst 染料可被紫外光（~360 nm）激发并发出蓝色荧光（~460 nm）。这些染料与氙汞灯以及紫外激光器兼容。它们非常适用于荧光显微镜、免疫组织化学和流式细胞术。 Hoechst 33258、33342 和 34580 之间的区别很重要。与 Hoechst 33258 相比，由于添加了亲油性乙基，Hoechst 33342 的渗透性明显更高。对于 Hoechst 34580，与 Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 的 461 nm 发射最大值相比，发射最大值略微蓝移，位于 437 nm。
YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1
YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1是基于化合物恶唑黄的花青染料系列。然而，尽管名称如此，这些染料实际上发出绿色而不是黄色的荧光。例如，YOYO-1（及其化学等价物 DiYO-1）的最大发射波长为 509 nm。 TOTO-1（及其化学等价物 DiTO-1）也是如此；该化合物的最大发射波长为 535 nm。这些化合物是嵌入剂，这意味着它们将自己插入 DNA 碱基对的平面之间。这个 DNA 探针家族以其对 DNA 的高亲和力而闻名。与 DNA 结合后，这些探针的荧光可以增加一千到三千倍。这种对 DNA 的强烈亲和力使它们非常适合需要高灵敏度的实验。不过，代价是这些探头相当昂贵。一毫升可能要花费数千美元。因为这些探针是细胞不可渗透的，它们不能穿过完整的细胞膜。它们非常适合染色固定或死细胞。在这方面，这些探针通常与流式细胞仪等平台一起用于细胞活力和细胞毒性测定。
